嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤大鼠模型血浆乌头碱含量的影响

韩志强 孙晓成 王 茜 安 达 巴图德力根

(内蒙古民族大学附属医院蒙药临床药理研究所,内蒙古 通辽 028007)



·基础研究·

嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤大鼠模型血浆乌头碱含量的影响

韩志强 孙晓成1王 茜2安 达 巴图德力根

(内蒙古民族大学附属医院蒙药临床药理研究所,内蒙古 通辽 028007)

目的 高效液相色谱法(HPLC)测定口服嘎日迪乌日勒的脑缺血再灌注损伤大鼠模型血清乌头碱含量。方法 Wistar大鼠按体重随机分为嘎日迪乌日勒低、高剂量组，每组10只，分别给予嘎日迪乌日勒0.18、0.36 g/kg，均按20 ml/kg体积灌胃给药，1次/d,连续给药7 d。给药7 d后禁食，不进水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，线栓法制备大脑中动脉闭塞模型(MCAO)，HPLC方法检测血浆乌头碱含量。结果 大鼠口服嘎日迪乌日勒7 d，未出现明显不良反应，血浆乌头碱含量在低、高剂量组分别为(2.68±0.61)，(2.50±0.82)μg/ml，两组间比较无明显差异。结论 处方剂量服用嘎日迪乌日勒是安全的。

嘎日迪乌日勒；乌头碱

蒙药嘎日迪乌日勒，蒙古名扎冲十三味丸，功能祛风通窍，舒筋活血，镇静安神，除“协日乌素”，用于半身不遂、左瘫右痪、口眼歪邪、四肢麻木、腰腿不利、言语不清、筋骨疼痛、神经麻痹、风湿、关节疼痛，收载于1998年版卫生部药品标准(蒙药分册)。研究表明，其急性毒性试验半数致死量(LD50)为2.96 g/kg，95%可信下限为2.60 g/kg、上限为3.36 g/kg，是成人临床用量的177.5倍；长期毒性试验无明显的慢性毒性反应和延缓毒性反应〔1〕。嘎日迪乌日勒对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其机制可能与调节脑组织中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(nNOS)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量有关。该方中含有剧毒成分双酯型二萜类生物碱、乌头碱。本研究采用高效液相色谱法(HPLC)〔2〕测定口服嘎日迪乌日勒后，脑缺血再灌注损伤大鼠模型血清乌头碱含量，为临床安全用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar大鼠SPF级，体重180～200 g，雌雄各半，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司购买，许可证号：SCXK(吉)-2011-0004。

1.1.2 药物 嘎日迪乌日勒由诃子、制草乌、石菖蒲、木香、人工麝香、珊瑚(制)、珍珠(制)、丁香、肉豆蔻、沉香、禹粮土、磁石(煅)、甘草等药材组成，由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室制备。乌头碱，中国食品药品检定研究院，批号为110720-201111,含量98.8%。

1.1.3 仪器 LC-20AT岛津高效液相色谱分析仪，日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组、给药、造模方法〔3〕Wistar大鼠按体重随机分为嘎日迪乌日勒低、高剂量组，每组10只，分别给予嘎日迪乌日勒0.18、0.36 g/kg，均按20 ml/kg体积灌胃给药，1次/d,连续给药7 d。给药7 d后禁食，不进水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，参照Longa等〔4〕采用的线栓法略加改良，制备大脑中动脉闭塞模型(MCAO)。对大鼠MCAO进行神经功能缺失评分：0分，没有神经功能缺损；1分(不能完全伸展对侧前爪)，轻度局灶性神经功能缺损；2分(向对侧转圈)，中度局灶性神经功能缺损；3分(向对侧倾倒)，重度局灶性神经功能缺损；4分，大鼠没有自发地行走，并且意识丧失。达到1～3分者纳入研究。再灌注24 h取各组存活大鼠麻醉后，腹主动脉取血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3 000 r/min离心5 min,取上清，-80℃保存，待测。

1.2.2 色谱条件〔5〕Hubble C18(250*4.6 mm，5 μm)；检测波长为245 nm。甲醇∶水∶二乙胺为75∶25∶0.1。柱温30℃，体积流速1.0 ml/min 。

1.2.3 对照品溶液的制备 称取乌头原碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液，配制成0.104 mg/ml的溶液，即得。

1.2.4 供试品溶液的制备 从-80℃冰箱中取出样本200 μl，放入80 μl氨水碱化样本，以1∶5的比例放入乙酸乙酯旋涡混合3 min，3 000 r/min离心5 min,取上清，氮气吹干，200 μl甲醇复溶，5 000 r/min,离心5 min,取上清，50 μl进样。

1.2.5 方法学验证试验

1.2.5.1 专属性 取空白血浆100 μl加对照品溶液100 μl，按上述供试品溶液制备方法制备，进样10 μl。

1.2.5.2 标准曲线和定量下限 取对照品溶液10、20、40、80、100 μl，分别加入空白血浆成为200 μl，放入80 μl氨水碱化样本，以1∶5的比例放入乙酸乙酯旋涡混合3 min，3 000 r/min离心5 min,取上清，氮气吹干，用200 μl甲醇复溶，5 000 r/min离心5 min,取上清100 μl，定容至1 000 μl，按照色谱条件进样10 μl，乌头碱浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5.3 精密度与重复性 (1)日内精密度：取对照品溶液10、40、100 μl各5份，分别加入空白血浆至200 μl，按照供试品溶液制备方法制备，取上清100 μl，定容至1 ml，分别进样10 μl，测其峰面积。(2)日间精密度：取对照品溶液10、40、100 μl，分别加入空白血浆至200 μl，按照供试品溶液制备方法制备，取上清100 μl，定容至1 ml，分别进样10 μl,每天测量一组，连续5 d，测其峰面积。

1.2.5.4 回收率 取对照品溶液10、40、100 μl各5份，分别加入空白血浆至200 μl，按照供试品溶液制备方法制备，取上清100 μl，定容至1 ml，分别进样10 μl。

1.2.5.5 稳定性 取对照品溶液40 μl，加入空白血浆160 μl，按照供试品溶液制备方法制备，取上清100 μl，定容至1 ml，进样10 μl,分别于1、2、4、6、8、10、12、24 h测其峰面积。

1.3 样品含量测定 取服用嘎日迪乌日勒的脑缺血再灌注损伤大鼠血浆200 μl，按上述血浆前处理方法进行制备，分别进样50 μl,测其峰面积，计算样品含量。

1.4 统计学分析 采用回归法对实验数据进行分析，回归方程以标准曲线及定量下限为线形范围，相对标准差以RSD值为准进行比较。

2 结 果

2.1 方法学评价

2.1.1 专属性 乌头碱保留时间为9.67 min，阴性对照无干扰，见图1。

a：乌头碱，1：对照品，2：样品，3：空白血浆图1 专属性试验对照品、样品、空白血浆色谱图

2.1.2 标准曲线及定量下限 回归方程为Y=6.18×106X-425.94，r=0.999 8；结果表明，在线形范围0.52×10-3μg/μl～0.52×10-2μg/μl之间呈现良好的线性关系，定量下限为1.47×10-3μg/μl。

2.1.3 精密度及重复性 见表1。

2.1.4 回收率试验 见表2。

2.1.5 稳定性 乌头原碱相对标准偏差RSD值为0.009%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2 服用嘎日迪乌日勒后脑缺血再灌注损伤大鼠血浆乌头碱含量 嘎日迪乌日勒低、高剂量组血浆乌头碱含量分别为(2.68±0.61)、(2.50±0.82)μg/ml。

表1 精密度试验及重复性试验结果±s)

表2 回收率试验结果

3 讨 论

蒙药嘎日迪乌日勒剧毒成分为双酯型二萜类生物碱乌头碱，小鼠经灌胃LD50为1.8 mg/kg〔6〕，人口服乌头碱0.12 mg即可中毒，3～5 mg可使人致死。本实验表明，大鼠按0.18、0.36 g/kg口服嘎日迪乌日勒7 d未出现明显不良反应，血浆乌头碱含量低，可能与口服7 d，达到血药浓度稳态有关。如按血浆2.50 ug/ml、大鼠含血液量10 ml、标准体重220 g计算，大鼠体内含乌头碱量约0.11 μg/kg，按体表面积换算为成人(60 kg)0.02 μg/kg，是人口服乌头碱中毒量的300分之一。以上结果表明按照处方剂量服用嘎日迪乌日勒是安全的。

1 韩志强,徐艳华,娜日苏,等.蒙药嘎日迪乌日勒毒理研究〔J〕.中国临床药理学杂志,2015;31(19):1940-2.

2 巴图德力根,布仁巴图,韩志强.HPLC法测定蒙药嘎日迪-13味丸中6种乌头类生物碱的含量〔J〕.中国临床药理学杂志,2015;31(19):1961-3.

3 田彩云,张浩楠,何静波,等.嘎日迪-13对局灶性脑缺血大鼠NSE、TNF-α、IL-6表达的影响〔J〕.中草药,2015;46(5):716-20.

4 Longa EZ,Weinstein PR,Carlon S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5 李文东,马 辰.高效液相色谱法测定大鼠组织中乌头碱的含量〔J〕.中国实验方剂学杂志,2007;13(7):56-8.

6 张宏顺.乌头类中药的毒性及中毒处理〔J〕.药物不良反应杂志，2005;7(2)：114.

〔2015-11-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

Determination of serum content of aconitine of Garidi-Wurile administered cerebral ischemia reperfusion injured rat by HPLC

HAN Zhi-Qiang,SUN Xiao-Cheng,WANG Qian,et al.

Institute of Clinical Pharmacology of Traditional Mongolia Medicine,Affiliated Hospital of Inner Mongolian University for the Nationalities,Tongliao 028007,Inner Mongolia,China

Objective To detect the serum acotine content of Garidi-Wurile(GRD-WRL) by HPLC administered cerebral ischemia reperfusion injured rat,which can provide scientific evidence for clinical application.Methods Wistar rats were randomly divided into GRD-WRL low and high dose groups by body weight,10 rat for every group.Rats in the GRD-WRL low and high dose groups wereintragastrically treated by 0.18 and 0.36 g/kg dosage of GRD-WRL in 20 ml/kg volume 1 time every day for 7 days.At the last day of drug administration,the rats were fasted 12 hours,and anaesthetized with 10% of chloral hydrate,then the model of middle cerebral artery occlusion was caused by intraluminal monofilament,and serum acotine contents were detected by HPLC.Results After 7 days of administration of GRD-WRL,no adverse drug reaction was observed.The serum contents of acotine were(2.68±0.61)，(2.50±0.82)μg/ml in GRD-WRL low and high dose groups respectively,there was no significant difference between two groups.Conclusions The clinical dosage of GRD-WRL is safe.

Garidi-Wurile;Aconitine

国家科技支撑计划基金资助项目(No.2012BAI27B02)

巴图德力根(1969-)，男，硕士，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事蒙药药理研究。

韩志强(1980-)，男，硕士，副主任医师，主要从事蒙药药理研究。

R991

A

1005-9202(2016)20-4941-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.001

1 内蒙古民族大学临床医学院 2 通辽市人民医院儿科