利用正交试验优化葡萄酒酵母冻干保护剂

2016-11-25王鸿磊王红艳刘彤

东方教育 2016年16期

王鸿磊+王红艳+刘彤

摘要：空冷冻干燥是保存微生物材料最有效的方法之一，冻干保护剂对冷冻干燥后微生物的存活率具有重要影响。本研究以烟台产区优良葡萄酒酵母菌为研究对象，通过单因素实验和正交试验设计，研究了脱脂乳粉、蔗糖和抗坏血酸3种物质对葡萄酒酵母冻干存活率的影响，结果表明，3种保护剂的保护效果依次为：蔗糖>脱脂乳粉>抗坏血酸；最佳保护剂的配方为：脱脂奶粉8%+蔗糖12%+抗坏血酸6%，加入优化后的冻干保护剂后，葡萄酒酵母冻干后存活率可达95.3%。

关键词：葡萄酒酵母；冷冻干燥；保护剂；正交优化

葡萄酒是一种营养丰富的低度发酵酒，是仅次于啤酒的第二大酒精饮料，深受人们的喜爱[1]。葡萄酒酿造是一个复杂的生物转化过程，葡萄酒质量的好坏与酵母菌有着密切的关系[2-4]。在世界著名的葡萄和葡萄酒产区，由于地理位置、气候、土壤等的不同，形成了各自不同的葡萄风格，各产区的酵母菌也逐渐适应了当地的气候、土壤和葡萄品种，形成了适于当地葡萄酒酿造的菌系[5]。国外在产地葡萄酒发酵专用酵母筛选上进行了一系列的研究，获得了一系列适于表现本地葡萄风格的专用酵母发酵剂，使得所酿葡萄酒具有很强的甚至独一无二的产地特性。然而，我国目前葡萄酒发酵中使用的酵母菌完全依赖进口，这种引进的发酵剂，往往在当地葡萄酒生产上并不能完全表现出其优良性状，不能完全体现产地葡萄的品质和特色[6]，降低了葡萄酒产品的独特性和风味的多样性，造成各地葡萄酒质量和风格的趋同化。因此，我国应加强本土葡萄酒酵母菌发酵剂的研究，以生产具有独特产地特性的优质葡萄酒。烟台产区是我国葡萄酒工业的发祥地，是我国最大的葡萄和葡萄酒的生产基地，拥有闻名于世的葡萄酒第七大葡萄海岸[7]，葡萄酒产量约占全国葡萄酒总产量的1/3[8]。烟台产区的葡萄酿出的葡萄酒具有区别于其他葡萄酒产区独特的海岸葡萄酒风格。烟台产区的葡萄园历史悠久，在葡萄园内形成了稳定的天然酵母区系，蕴含着丰富的天然酵母菌资源。

真空冷冻干燥（简称冻干）是制备和保存微生物材料最有效的方法之一[9]。利用此方法生产的发酵剂具有活菌存活率高，接种量小，保存期长等优点[10-15]。本研究以筛选自烟台葡萄园的优质葡萄酒酵母为研究对象，研究了不同冻干保护剂对葡萄酒酵母的保护效果，并通过正交试验对葡萄酒酵母冻干保护剂配方进行了优化，为研发适于烟台产区的优质活性葡萄酒干酵母发酵剂提供技术支持。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：葡萄酒酵母：本实验室分离保藏。

1.1.2 试剂、培养基：蔗糖、抗坏血酸、脱脂奶粉、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDA液体培养基）、马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA固体培养基）

1.1.3 仪器设备：超净工作台（上海博讯实业有限公司）、恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）、电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）、万分之一分析天平（赛多利斯）、冷冻干燥机（东京理化）、恒温振荡器（上海博讯实业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄酒酵母增殖培养

将葡萄酒酵母接种于PDA培养基斜面上，28℃活化24h，将活化的菌种接入PDA液体培养基中，28℃，180r/min培养48h。

1.2.2 单因素试验及正交优化试验

取增殖培养后的培养液4000r/min离心20min，弃上清液，用无菌生理盐水清洗3遍，补入同体积保护剂，制成悬浮液。

1.2.3 预冻

将均匀混合了保护剂的菌悬液转入冻干瓶中，在-85℃的低温条件下预冻12h至样品完全冻结后取出。

1.2.4 冷冻干燥

将预冻完结的菌悬液置于冷冻干燥机中进行干燥处理，待菌悬液完全成粉末状时预示冷冻干燥完成。

1.2.5 冷冻存活率计算

利用平板涂布法测定冻干前后酵母菌的活菌数，利用以下公式计算存活率。

1.2.6 数据分析

采用SPSS软件对数据进行分析，采用OriginPro7.5进行图形绘制。

2 结果分析

2.1葡萄酒酵母冻干保护剂的单因素试验

2.1.1 脱脂奶粉浓度菌体存活率的影响

在生理盐水中加入脱脂奶粉，使脱脂奶粉的终浓度达到4%、6%、8%、10%、12%，冻干后测定酵母存活率，结果如图1所示。

随着脱脂奶粉加量的增加，酵母的存活率逐渐上升，脱脂奶粉浓度达到8%，酵母存活率达到最高，之后随着脱脂奶粉浓度的增加，酵母存活率逐渐降低。

2.1.2蔗糖浓度菌体存活率的影响

在生理盐水中加入蔗糖，使蔗糖的终浓度达到9%、10%、11%、12%、13%、14%，冻干后测定酵母存活率，结果如图2所示。

蔗糖对酵母存活率的影响与脱脂奶粉相似，随着蔗糖浓度的增加，酵母的存活率逐渐上升，蔗糖浓度达到12%时酵母存活率达到最高，之后随着蔗糖浓度的增加，酵母存活率略有下降。

2.1.3抗坏血酸浓度菌体存活率的影响

在生理盐水中加入抗坏血酸，使抗坏血酸的终浓度达到4%、6%、8%、10%、12%，冻干后测定酵母存活率，结果如图3所示。

抗坏血酸浓度达到8g/L时酵母存活率达到最高，之后随着抗坏血酸浓度的增加，酵母存活率逐渐降低。

2.2 葡萄酒酵母冻干保护剂的正交优化

在单因素的基础上，为获得最佳的保护剂配方，采用三因素三水平正交试验设计对脱脂乳粉、蔗糖和抗坏血酸3个因素进行考察，确定最佳的保护剂组合。各种保护剂水平设计见表1。

按表1的因素水平设计正交试验，其结果如表2所示。

由表2极差R分析可知，3种保护剂对菌种存活率影响由大到小顺序为B>A>C，即蔗糖对酵母存活率影响最大，其次是脱脂乳粉，最后是抗坏血酸。根据极差分析，酵母存活率最高的组合为A2B2C1，由于这个组合不在已做的9次试验中，所以对其进行了验证，结果如表3所示。

经过三次重复试验，葡萄酒酵母菌的存活率平均达到95.3%，均高于表2中的存活率，所以最佳组合为A2B2C1，即最佳冻干保护剂配方为：脱脂奶粉8%+蔗糖12%+抗坏血酸6%。

3 讨论

在冷冻干燥技术制备葡萄酒酵母制剂的过程中，冷冻是导致酵母菌死亡的主要原因。冻干保护剂的加入将大大提高酵母菌冷冻干燥后的存活率。试验证明3种保护剂中蔗糖的保护效果是最好的。由于蔗糖具有多个羟基，可以阻止细胞膜因失水而融合，可与蛋白质形成氢键防止蛋白质因冻干而变性，同时蔗糖在溶液中易结合水分子，减缓了晶核的生长过程，所以具有很好的保护细胞的作用。但是单靠蔗糖一种保护剂不能达到最佳的保护效果，本试验利用三种保护剂的协同作用，得到了高于单一保护剂的酵母存活率，为进一步研制活性干酵母奠定了基础。

参考文献：

[1]赵晓莉，周广麟，梁颖等.快速酿造葡萄酒酵母的筛选.大连轻工业学院学报.2005，24（2）：132-134

[2]张超，王玉霞，刘树文.葡萄酒酵母选育研究进展.南方农业.2007，1（2）：44-48

[3]杨莹，徐艳文，薛军侠等.葡萄酒相关酵母的香气形成及香气特征.微生物学通报.2007，34（4）；757-760

[4]杨莹，徐艳文，薛军侠等.葡萄酒相关酵母的香气形成及香气特征.微生物学通报.2007，34（4）；757-760

[5]王慧，张立强，刘天明等.产地葡萄酒优良酵母菌株的筛选及鉴定.酿酒科技.2007，（9）：29-31，34

[6]冯作山.优良葡萄酒酵母的选育及发酵性能研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2000

[7]吴伟洪.烟台蓬莱成世界第七大葡萄海岸产区.http：//finance.sina.com.cn/o/20050823/1051278369.shtml

[8]烟台葡萄与葡萄酒局成立谋划葡萄产区联盟.http：//www.chinadaily.com.cn/m/shandong/c/2010-12/21/content_11735650.htm

[9]周德庆，微生物教程（第二版），北京：高等教育出版社，2012

[10]古元懿，等.保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干工艺条件的研究.中国乳品工业.2008，4：48-49

[11]陈卫，陆英，田丰伟等.干酪乳杆菌LC-15冻干发酵剂制备条件研究.中国乳品工业.2008，36（7）：9-10