红景天苷对大鼠颅脑损伤的保护作用研究

李茂林 王祝峰 章薇 毛星刚 李剑 贺亚龙* 章翔* ( 武警陕西省总队医院神经外科，陕西 西安 70054; 第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 7003)

·论著·

红景天苷对大鼠颅脑损伤的保护作用研究

李茂林1王祝峰1章薇2毛星刚2李剑2贺亚龙2*章翔2*
(1武警陕西省总队医院神经外科，陕西 西安 710054;2第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

目的探讨红景天苷(Salidroside, Sal)对大鼠颅脑外伤的神经保护作用及其机制。方法健康成年SD大鼠36只，随机分为3组：假手术组(Sham组)、对照组(TBI组)、Sal给药组(TBI+Sal组)。通过Feeney's自由落体打击法制作大鼠颅脑损伤模型，24 h后对大鼠神经功能损伤评分，对神经元行尼氏(Nissl)染色，检测动物损伤脑组织中GSH、SOD及MDA的水平，Tunel染色检测细胞凋亡。结果TBI+Sal组较TBI组，降低了神经功能缺损评分、细胞凋亡数量、MDA水平，显著增加了Nissl阳性细胞的数量、SOD的活性以及GSH的水平。结论Sal能减轻大鼠TBI后神经功能缺损，具有神经保护作用，此作用依赖于抗氧化及抗凋亡的作用机制。

红景天苷; 颅脑外伤; 氧化应激; 神经保护; 细胞凋亡

创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)在平、战时发生率高，占全身损伤总数的10%～20%，其中重型颅脑损伤死亡率高达35%～60%，且战伤阵亡中颅脑伤居首位，是青壮年人群的首要死亡原因[1]，而继发性脑损伤的救治是目前研究的重点。颅脑创伤后，损伤灶部位脑组织产生大量的自由基和炎症介质引起神经元水肿和坏死，是导致继发性脑损伤的一个重要因素。

红景天是蔷薇目景天科(crassulaceae)红景天属(rhodiola)[2]，主要生长在海拔1 600～4 000 m 的高寒、干燥、缺氧、强紫外线照射、昼夜温差大的地区，它具备了其它植物所没有的特殊适应性的物质。红景天苷(salidroside, Sal)是草本植物红景天的主要化学成份之一，生物学活性显著，可有效清除机体内过多自由基，有防辐射及抗疲劳的双重作用以及很好的抗缺氧、抗衰老、抗心肌缺血、提高免疫力等作用[3]。本研究将采用大鼠TBI模型，探讨Sal对TBI的神经保护作用。

材料与方法

一、实验动物

健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠36只，体质量 260～300 g，购自第四军医大学实验动物中心。由第四军医大学第一附属医院神经外科研究所动物室饲养,温度、湿度可控，明暗环境12 h交替，自由觅食、水。

二、分组及大鼠TBI模型制作

本组大鼠随机分为3组：假手术组(Sham)、对照组(TBI组)、Sal给药组(TBI+Sal组)，每组12只，其中6只用作神经功能评分、尼氏染色、TUNEL染色；另外6只用作生化指标检测。TBI组与TBI+Sal组依据通过Feeney's自由落体打击模型(Feeney's weight-drop model )制作大鼠颅脑损伤模型[4]。动物由10% 水合氯醛麻醉后(400 mg/kg, IP)，固定于 大鼠脑立体定向框架上，剪开右顶部皮肤，采用环钻开圆形骨窗(前囟后3.5 mm，中线旁2.5 mm，直径5 mm)，显露硬脑膜，用20 g直径4.5 mm砝码由30 cm高处沿外周导管坠落，下压脑组织2.5 mm；Sham组麻醉后仅行颅骨开窗后缝合伤口。所有动物术后都置于保温毯上，直至其麻醉苏醒。

三、药物准备及给药方法

Sal购自中国药品生物检定所 ，纯度>99%。将 其溶于Tween 80 (Sigma, St. Louis, MO, USA)。TBI+Sal组动物术后立即给予Sal腹腔注射(40 mg/kg), SHAM组及TBI组手术则给予等体积不含Sal溶液腹腔注射。

四、神经功能评分

利用肢体抓握试验和平衡木试验作为其伤后24 h神经功能评估方法[4]。该评分方法分数代表神经功能缺损程度：0分代表无神经功能缺损；8分代表严重神经功能缺损。

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肢体抓握试验：将大鼠置于120 cm长、离地80 cm高的拉紧之细绳上，并记录其停留时间(0分=大鼠紧握绳索60 s以上并爬行迅速；1分=大鼠利用其后肢抓握绳索60 s以上爬行缓慢；2分=大鼠无法利用其后肢抓握绳索，无法爬行，但可停留60 s以上；3分=大鼠仅可在绳索上停留30～60 s；4分=大鼠30 s内掉下绳索)。平衡木试验：将大鼠置于宽1.5 cm平衡木上，观察并记录停留时间(0分=大鼠可以轻松行走并自由掉头；1分=大鼠可于平衡木上保持60 s以上；2分=大鼠可利用肢体钩挂于平衡木60 s以上；3分=大鼠30 s至60 s间于平衡木掉落；4分=大鼠30 s内于平衡木掉落)。

五、尼氏染色

伤后24 h将大鼠麻醉、以生理盐水、4%多聚甲醛顺序灌注后，完整取脑，以4%多聚甲醛 固定过夜，水洗、石蜡包埋，石蜡切片机切片(Leitz 1512, Leica, Bensheim, Germany)，厚度为 4 μm。60℃ 烤片机拷片过夜后，梯度脱蜡、脱水，56℃温箱内焦油紫液 染色1 h，用蒸馏水冲洗，70%酒精分化。至显微镜下观察时见背景无色 ，细胞及尼氏小体有明显 的轮廓为度 ； 以无水酒精急速脱水 5 s，入氯仿 5 s，二甲苯透明 ，封片剂封片。

选取位于局灶伤下的海马CA2区(前囟后3 mm 间隔选取6张冠状面切片)进行显微镜下采集图像、神经元计数(DP70, Olympus, Tokyo, Japan)，以神经元胞体、胞核完整为计数标准。

六、 生化指标检测

大鼠伤后24 h处死，迅速取脑，于冰上分离右侧海马组织、-80℃保存，将组织用生理盐水匀浆后进行蛋白提取及浓度测定(考马斯亮兰法)。利用脂质过氧化物、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)检测其氧化、抗氧化水平，脂质过氧化物的评估由检测丙二醛(MAD)进行反应。 依据各检测试剂盒操作说明逐步施行，试剂盒购自南京建成生物工程公司。

七、 TUNEL染色

利用TUNEL染色检测伤后24 h脑组织切片中细胞凋亡情况，选取 Dead End TM 荧光TUNEL 系统 (Promega, Madison, WI, USA)。 碘化丙啶(Propidium iodide, PI)可将凋亡与非凋亡细胞均着红色，荧光素-12-dUTP只将凋亡细胞胞核着绿色。共聚焦显微镜(FV1000, Olympus)600倍下每张切片，随机选取10个视野进行计数。

八、统计学分析

所有数据均用 mean±SD (standard deviation) 表示 ，采用 SPSS 16.0 统计软件进行数据分析。统计分析选取单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，组间两-两比较采用 Tukey 检验法 ，P<0.05为差异有统计学意义 。

结 果

一、Sal对颅脑外伤后神经功能缺损评分的影响

致伤前所有实验动物都进行训练，Sham组无神经功能缺损，伤后24 h TBI组神经功能缺损评分显著增高，而TBI+Sal组神经功能缺损评分明显低于TBI组，且具有统计学意义(P<0.05)(图1)。

二、Sal对颅脑外伤后神经元损伤的影响

神经元是神经系统的结构和功能单位，尼氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神经元胞体和树突内。我们采用尼氏染色对神经元损伤程度进行评估， 与Sham组相比，伤后24 h TBI组CA2区神经元数量显著减少(P<0.01)，而TBI+Sal组神经元数量明显高于TBI组，且具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

三、Sal对颅脑外伤后氧化应激反应的影响

我们利用丙二醛(MAD)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)检测其抗氧化水平。 与Sham组相比，伤后24 h TBI组MDA水平升高、SOD活性、GSH水平显著降低 (P<0.01)；而伤后给予Sal后，与TBI组相比明显降低了MDA水平，增加了SOD活性和GSH水平(P<0.05 ) (图3)。

四、Sal对颅脑外伤后细胞凋亡的影响

我们采用TUNEL染色对伤后细胞凋亡情况进行评估， 与Sham组相比，伤后24 h TBI组细胞凋亡数量显著增加(P<0.01)，而TBI+Sal组相应区域凋亡细胞数量明显低于TBI组 (P<0.05) (图4)。

五、统计学分析

图1 伤后24 h红景天苷对各组大鼠神经功能缺损的影响 (n=6)

Fig 1 Effect of Sal on neurological deficits at 24 h following TBI in rats (n=6)

aP<0.05,vsTBI.

图2 尼氏染色显示伤后24 h大鼠CA2区神经元数量 (n=6)

Fig 2 Nissl staining of the hippocampus in different groups (n=6)

A: Sham group; B: TBI group; C: 40 mg/kg Sal + TBI group; D: Number of neurons in CA2 area of the right side hippocampus.

aP<0.01,vsSham;bP<0.05,vsTBI.

Bar=100 μm.

图3 伤后24 h各组大鼠生化指标含量(n=6)

Fig 3 Effect of Sal on the contents of MDA and GSH, and the activity of SOD at 24 h post TBI (n=6)

A: The level of MDA; B: The activity of SOD; C: The level of GSH.

aP<0.01,vsSham;bP<0.05,cP<0.01,vsTBI .

图4 伤后24 h各组大鼠致伤脑组织细胞凋亡情况 (n=6)

Fig 4 TUNEL staining of the cortex in different treatment groups (n=6)

A: TUNEL staining of the right side parietal cortex. Propidium iodide (PI) stains both apoptotic and nonapoptotic cells red. Fluorescein-12-dUTP incorporation results in localized green fluorescence within the nucleus of apoptotic cells only; B: Relative ratio of TUNEL positive cells.

aP<0.01,vsSham;bP<0.05,cP<0.01,vsTBI.

讨 论

TBI在平、战时发生率高，系全世界每年致残、致死的重要原因，为一全球性的健康问题，但目前仍缺乏有效的治疗手段来改善患者预后[6]。目前研究认为，TBI致伤原因主要包括原发脑损伤和二次脑损伤：原发脑损伤多为脑挫裂伤、弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)等；而二次脑损伤主要包括脑出血、炎症反应、氧化应激以及神经元死亡等。TBI的病理生理机制复杂，损伤灶部位脑组织产生大量的自由基引起氧化应激反应(reactive oxygen species, ROS) ，该产物可通过氧化脂质、蛋白以及DNA最终使细胞损伤甚或死亡[7]。自由基所致脂质过氧化物是TBI后二次脑损伤的重要影响因素，它可导致细胞损伤或继发性死亡。如何预防及治疗二次脑损伤是目前TBI研究的重点内容[8]。因此，通过获得外源性抗氧化物质来支持内源性防御机制，增强过氧化物的清除能力，是治疗TBI的一大策略，而研究一种行之有效的抗氧化治疗方法就显得尤为重要了。

Sal是草本植物红景天的主要化学成份之一，其生物学活性十分明显。近年来研究还发现，它具有抗缺氧、抗疲劳、抗衰老、对心血管的保护作用、以及抗肿瘤、防辐射等多种生物作用[3]。Sal在链脲佐菌素诱导糖尿病模型大鼠中具有提高海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元的表达，改善学习记忆的功能[9]。此外，Sal对百草枯诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，提升了细胞抗氧化能力，减少氧化应激损伤，维持了细胞线粒体正常功能[10]。但Sal是否具有TBI后的神经保护作用，目前还未见报道。

本实验采用Feeney's自由落体打击法制作大鼠颅脑损伤模型[11]，该模型很好地模拟了现实临床工作中TBI的损伤特点，包括行为学、组织病理学等。我们将成年大鼠致伤后，立即给予Sal腹腔注射治疗，于24 h后发现，Sal能明显地减轻大鼠神经功能缺损程度，并降低了海马区CA2区神经元的损失。这表明了Sal对TBI的神经保护作用，提示其具有改善TBI的预后功能。

多项研究证实，Sal具有抗氧化作用，我们在研究中利用脂质过氧化物、SOD活性以及GSH水平来评估Sal在氧化应激反应中的作用。MDA是一脂质过氧化反应的副产物，可用来评估脂质过氧化反应程度。GSH为一种最重要的非蛋白硫醇，系ROS关键的清除剂。本研究发现，TBI组致伤24 h后MDA水平明显升高，SOD活性及GSH水平显著下降。而治疗组Sal(40 mg/kg)则明显地减弱了MDA的升高水平、增加了SOD活性和GSH水平。研究结果提示，Sal可降低ROS产物生成，提高了抗氧化能力，从而有效地减轻了TBI所致二次脑损伤。神经元凋亡是TBI后迟发性细胞死亡重要的组成部分[12]，本研究结果显示，TBI后脑挫伤皮层组织细胞大量凋亡，而Sal明显地减少了TUNEL染色阳性细胞率，减轻细胞凋亡，提示Sal增强了TBI后脑组织的抗凋亡能力。

综上所述，大鼠TBI后立即给予Sal进行治疗，可以减轻脑损伤(包括神经功能缺损、海马神经元的损伤、迟发性的细胞凋亡以及氧化应激反应)。我们认为，Sal具有神经保护作用，其主要保护机制可能是通过抗氧化和抗凋亡来实现的。因此，Sal为TBI所致二次脑损伤提供了一种潜在的治疗策略。

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9郎云峰, 孟可, 赵珩. 红景天苷对糖尿病模型大鼠海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元的影响 [J]. 吉林医学, 2014, 35(19): 4133-4135.

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12Ng I, Yeo TT, Tang WY, et al. Apoptosis occurs after cerebral contusions in humans [J]. Neurosurgery, 2000, 46(4): 949-956.

Theprotectionofsalidrosideagainsttraumaticbraininjuryofadultrats

LIMaolin1,WANGZhufeng1,ZHANGWei2,MAOXinggang2,LIJian2,HEYalong2,ZHANGXiang2

1DepartmentofNeurosurgery,ArmedPoliceCorpsHospitalofShaanxi,Xi'an710054;2DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe potential protection of salidroside on adult rats against the traumatic brain injury (TBI) was investigated.MethodsThirty-six adult rats were randomly divided into three groups, ie, sham group, TBI group and TBI+Sal group. We employed Feeney's weight-drop model to ascertain whether intraperitoneal administration of salidroside (40 mg/kg) post TBI could reduce the severity of neurological deficits and hippocampal neuron loss. The levels of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH), the activity of superoxide dismutase (SOD), and the number of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)-positive apoptotic cells were also measured to characterize the antioxidative and antiapoptotic properties.ResultsA significant reduction of neurological deficits and hippocampal neuron loss was observed in the TBI+sal group (40 mg/kg) at 24 h after TBI compared with the TBI group. Furthermore, administration of salidroside (40 mg/kg) significantly increased the activity of SOD, the level of GSH, and also reduced the level of MDA and the number of apoptotic cells at 24 h after TBI.ConclusionIn summary, these results suggests that salidroside plays a neuroprotective effect against TBI, which may be associated with its antioxidative and antiapoptotic functions.

Salidroside; Traumatic brain injury; Oxidative stress; Neuroprotective effect; Apoptosis

1671-2897(2016)15-128-04

R 651

A

国家自然科学基金资助项目(81471266, 81302174)

李茂林，主任医师，E-mail: 3355698699@qq.com

*通讯作者： 贺亚龙，讲师、主治医师，E-mail：471084676@qq.com；章翔，教授、主任医师，博生生导师，E-mail: xzhang@fmmu.edu.cn

2016-02-06；

2016-02-25)