服用阿司匹林对脑出血周围组织水肿影响的实验研究

贺昭忠 徐文斐 郑淑芳 刘福生 (青岛大学附属医院神经外科，山东 青岛 266003)

服用阿司匹林对脑出血周围组织水肿影响的实验研究

贺昭忠*徐文斐 郑淑芳 刘福生
(青岛大学附属医院神经外科，山东 青岛 266003)

目的探讨长期服用阿司匹林是否对脑出血周围组织水肿有一定的影响。方法Wistar大鼠70只，随机分为三个组：阿司匹林预处理脑出血组、阿司匹林预处理假手术组及非阿司匹林预处理脑出血组。阿司匹林预处理脑出血组及非阿司匹林脑出血组各30只，阿司匹林预处理假手术组10只，每组分3 h，1 d，3 d，5 d，7 d五个时间点。在相应的时间点灌注取脑，测定出各组不同时间点脑出血周围水肿组织中水通道蛋白(AQP4)的表达情况，并进行对比研究。结果①AQP4在各组各个时间点的表达分别是：阿司匹林(ASA)预处理脑出血组AQP4表达水平在脑出血后第三天达到最高峰，与未服用ASA脑出血组高峰期是一致的。②对ASA预处理脑出血组与非ASA预处理脑出血组大鼠血肿周围水肿组织AQP4表达各时间点比较，无显著差异。结论①长期服用阿司匹林脑出血后3 h血肿周围组织出现水肿；②3 d后水肿达最高峰，水肿持续7 d，与未服用阿司匹林脑出血组织水肿程度表现是一致的；③长期服用阿司匹林对脑出血周围水肿严重程度无显著影响。

阿司匹林; 脑出血; 水通道蛋白4; 大鼠

长期服用阿司匹林脑出血患者死亡率及致残率明显高于未服用阿司匹林患者[1]，除了服用阿司匹林导致血肿较易扩大、易再出血等原因是否存在其他原因？脑出血患者死亡率及致残率高主要与血肿对脑组织的直接破坏有关，脑出血后周围组织水肿对脑组织的损害也影响患者的转归[2]。本实验通过检测水通道蛋白(aquaporin-4, AQP4)在服用阿司匹林大鼠脑出血周围水肿组织表达情况并与未服用阿司匹林大鼠血肿周围水肿脑组织表达对比研究，明确两者间是否存在显著差异。

材料与方法

一、实验动物及分组

成年Wistar大鼠70只，体质量250～300 g。随机分为三组，A组：阿司匹林预处理脑出血组、阿司匹林预处理假手术组；B组：非阿司匹林预处理脑出血组。每组分3 h，1 d，3 d，5 d，7 d五个时间点，阿司匹林预处理脑出血组和非阿司匹林预处理脑出血组每时间点6只，阿司匹林预处理假手术组每个时间点2只。将阿司匹林泡腾片100 mg/片溶于40 ml 0.9%生理盐水中，术前连续灌胃2 w，每天1次，A组剂量为10.5 mg/kg[3]，每7 d根据体重调整阿司匹林灌胃剂量，B组给予同等容量的生理盐水灌胃。

二、动物模型的制备

大鼠脑出血模型制备：应用江湾I型鼠脑立体定向仪，制备大鼠脑出血模型。①大鼠灌胃3 w，称取重量后，应用10%水合氯醛腹腔注射麻醉实验大鼠(300 mg/kg)。②麻醉成功后的大鼠俯卧位固定在鼠脑立体定向仪上(图1)，使前后囟在同一水平面上，头部术区备皮，75%酒精消毒，在头部正中线沿矢状缝方向切开皮肤，长约3 cm，向两侧推开骨膜，双氧水止血，显露出前囟，前囟后0.2 mm，中线右侧旁开3 mm，标记笔标记，应用牙科细钻头钻孔，直径约1 mm，垂直进针深度5.5 mm。在助手协助下，自大鼠尾动脉抽取不抗凝动脉血50 μl。③应用二次退针法，进针后先缓慢注射10 μl，停针2 min，后继续缓慢注射剩余40 μl血液，停针5 min后，缓慢退针2 mm，停留10 min后，缓慢将针拔出，骨蜡封堵颅骨骨孔，缝合切口，术区酒精消毒，预防感染。④麻醉苏醒后3 h，应用Longa评分法评价实验大鼠的神经功能缺失。1～3分的实验大鼠纳入为研究对象，脑组织切片血肿破入脑室、血液沿进针道反流等不符合条件的大鼠剔除，并随机补充实验大鼠。

三、标本的采集及处理

在相应的时间点，称重后腹腔麻醉大鼠，仰卧固定于解剖板上，固定四肢，开胸充分暴露心脏，夹住腹主动脉，灌注针自左心室尖部插入送至主动脉内妥善固定，剪开右心耳，0.9%生理盐水快速由灌注针滴注，无血液流出后换4%多聚甲醛灌注。灌注完毕后断头取脑(图2)，脑组织注血点前1 mm冠状位切开脑组织，向后选取厚度为0.5 cm脑组织(图3)用10%甲醛浸泡固定24 h，脱水，包埋，切片，用作HE染色及AQP4的测定。

四、统计学分析

图1 大鼠固定于立体定向仪图2 多聚甲醛灌注鼠脑图3 大鼠脑组织血肿图片

Fig 1 Wister rat was fixed on stereotaxic apparatus Fig 2 The Wister rat brain was irrigated with paraformaldehyde Fig 3 The picture of cerebral hemorrhagein in Wster rat

结 果

AQP4空白对照应用PBS代替一抗。免疫组织化学方法检测显示大鼠脑组织血肿周围水肿带中AQP4的表达结果：光镜下，水肿带的脑胶质细胞包体及周围神经纤维网呈空泡样改变，细胞包膜上棕褐色深染，AQP4主要分布于星形胶质细胞细胞包膜[4]。HE染色光镜下，3 h时神经胶质细胞胞体出现肿胀，3 d时，细胞肿胀达到高峰，水肿带细胞胞体及周围神经纤维网出现大量空泡，血肿部位及其周围脑组织出现炎性细胞增生，核分裂增强。阿司匹林(aspirin, ASA)预处理脑出血组及对照脑出血组中3 h脑组织水肿带中AQP4表达均升高，在3 d时AQP4表达达到高峰，7 d后其AQP4表达水平仍高于ASA预处理假手术组(图4，表1)。

一、ASA预处理组与非ASA预处理组比较

AQP4在ASA预处理组出血后3 h、1 d、3 d、5 d、7 d的表达与非ASA预处理组比较差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。

二、ASA预处理组与ASA预处理假手术组比较

AQP4在ASA预处理组出血后3 h、1 d、3 d、5 d、7 d的表达与ASA预处理假手术组比较差异明显，有统计学意义(P<0.05)。

Group3h24h3d5d7d ASA37．31±2．01a42．85±1．45a50．64±1．64a44．25±1．49a39．72±1．37a NOASA37．07±2．3742．65±1．7150．57±2．2444．10±1．8339．40±1．84 ASAoperated11．21±1．6511．21±1．6511．21±1．6511．21±1．6511．21±1．65

aP<0.05,vsASA operated group.

图4 AQP4在服用阿司匹林及未服用阿司匹林大鼠脑出血周围水肿组织不同时间点的表达(×400)

Fig 4 Immunohistochemical staining of AQP4 on edema brain after cerebral hemorrhage in rats with aspirin or without aspirin(×400)

A: The expression of AQP4 at 3 h after cerebral hemorrhage in ASA group; B: The expression at 1 d; C: The expression at 3 d; D: The expression at 5 d; E: The expression at 7 d; F: The expression of AQP4 at 3 h after cerebral hemorrhage in No ASA group; G: The expression at 1 d; H: The expression at 3 d; I: The expression at 5 d; J: The expression at 7 d.

讨 论

阿司匹林(aspirin)又称乙酰水杨酸，可使前列腺素(prostaglandin, PG)合成酶活性中心的丝氨酸乙酰化失活，从而阻断环氧化酶(cyclooxygenase, cox)的催化位点与底物的结合，不可逆地抑制血小板环氧酶，其失活后不能重新生成，减少了血小板中血栓素A2生成，从而影响血小板的聚集及抗血栓形成，达到抗凝作用[5]。血小板的平均生命周期为7～10 d，其更新速度约为10%/d，每天服用1次阿司匹林即可达到有效浓度，维持抗血栓的作用[6]。 阿司匹林在心脑血管疾病一级和二级预防中的作用已达到广泛认可[7]，随着人民生活水平及文化程度的提高，许多中老年人长期服用小剂量的阿司匹林来预防心脑血管缺血性疾病一级和二级预防[8]。最近研究显示长期服用阿司匹林其发生脑出血的风险较服用安慰剂增加25%，其严重的颅内出血风险增加50%[9]。还显示服用阿司匹林的患者在发生脑出血后，预后较非服用阿司匹林患者差[10]。

本实验研究结果显示：ASA预处理组的大鼠与非ASA预处理的大鼠在血肿周围水肿带中AQP4的表达水平无统计学差异(P>0.05)。说明长期服用阿司匹林脑出血患者临床治疗效果差于未服用阿司匹林者主要是由于阿司匹林影响到了人体组织凝血机制，使得一旦出现脑出血，出血不易停止，脑出血的的量常常多于未服用阿司匹林者，而不是由于其周围水肿严重于未服用者。另外，由于本实验选用的动物数量较少，服用阿司匹林的时间不是太长，得出的结果还需选择更多的实验动物继续研究。本实验在服用ASA组与非ASA组中的大鼠其模型的出血量是一定的，这与自发性的高血压脑出血有一定的差异。与临床诊疗中，长期规律服用阿司匹林脑出血的患者通常较未应用阿司匹林的患者预后差[11]，可能与以下几方面因素有关：①长期服用阿司匹林患者脑出血时，出血量常较未服用阿司匹林患者出血量大。②由于其血液凝固性差，发生再出血的概率较未服用阿司匹林患者高，预后差。③需要服用阿司匹林的患者可能患有更严重基础疾病(如冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压等)，无论其手术还是保守治疗，其恢复较慢。④服用阿司匹林患者较未服用阿司匹林患者在需要手术治疗时，由于服用阿司匹林抑制了血小板正常的功能，血液凝固性差，术中出血量大、止血困难，手术时间长，对脑组织损伤大。⑤脑出血对脑组织的损害除了出血造成脑组织的直接损害，还与血肿的占位效应有关，血肿造成了周围脑组织微循环障碍，血-脑屏障受损，及血肿分解的活性物质及炎性成分对脑组织的损害[12]。本实验研究结果显示：脑出血组大鼠血肿周围脑水肿带区域AQP4的表达在3 h时出现升高，在3 d时，其表达量达到高峰，随后其表达降低，7 d时达到最低，但仍高于假手术组的大鼠。本实验结果与以往研究结果相似。服用ASA组的大鼠与未服用ASA组的大鼠AQP4升高曲线大致相同，差异无统计学意义。

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Effectofirrigationwithaspirinonexpressionofaquaporin-4inedemabrainaftercerebralhemorrhageinrats

HEZhaozhong,XUWenfei,ZHENGShufang,LIUFusheng

DepartmentofNeurosurgery,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003, China

ObjectiveThe effect of irrigated with aspirin on the expression of aquaporin-4 (AQP4) on edema brain after cerebral hemorrhage in rats was investigated.MethodsA total of 70 adult male Wistar rats were divided randomly into three groups: aspirin-irrigation group with 30 rats (ASA group), aspirin-irrigation and hemorrhage removal group with 30 rats (ASA operation group) and water-irrigation group with 10 rats (No ASA group). And the analysis was performed at 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, and 7 d after cerebral hemorrhage. The expressions of AQP4 on edema brain after cerebral hemorrhage in rats in all groups were analyzed.ResultsThe expression of AQP4 peaked at 3 d after cerebral hemorrhage to ASA group, which was consistent with No ASA group. There was no significant difference in the expression of AQP4 at all the time points between ASA group and No ASA group (P>0.05).ConclusionThe brain edema appears at 3 h following cerebral hemorrhage in rats with aspirin irrigation, peaks at 3 d and lasts for 7 d. There is no difference between ASA and No ASA group. Aspirin irrigation has no effect on the brain edema after cerebral hemorrhage.

Aspirin; Cerebral hemorrhage; AQP4; Rat

1671-2897(2016)15-105-04

·脑血管疾病研究·

R 739.41

A

青岛市科技局基金资助项目(12-1-4-2-20)

贺昭忠，教授、主任医师，硕士生导师，E-mail: hezhaozhong1988@aliyun.com

*通讯作者： 贺昭忠，教授、主任医师，硕士生导师，E-mail: hezhaozhong1988@aliyun.com

2015-11-01；

2015-12-30)