YKL-40对MGMT高表达的人胶质瘤干细胞“干性”的影响

陈蔚军 章薇 章翔

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

·论著·

YKL-40对MGMT高表达的人胶质瘤干细胞“干性”的影响

陈蔚军 章薇*章翔*

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

目的研究YKL-40在MGMT高表达的人胶质瘤干细胞(hGSCs)中对其干性的影响。方法收集临床胶质母细胞瘤样本，行分离、培养并进一步鉴定为hGSCs。YKL-40慢病毒干涉后，采用单细胞克隆球形成实验、BrdU细胞增值实验检测、RT-PCR法和Western blot法检测hGSCs中干性表达及生物学功能的改变。结果所入围的hGSCs中MGMT均为高表达，并且高表达YKL-40的hGSCs其单细胞成球能力、细胞增殖能力及干性表达均高于低表达YKL-40的hGSCs(Plt;0.05)。结论YKL-40在hGSCs干性维持的过程扮演了重要的角色，YKL-40有可能作为GBM手术后分子靶向治疗的关键靶点，并作为临床GBM诊治提供新的思路。

胶质母细胞瘤; 肿瘤干细胞; YKL-40; MGMT

胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)或高级别的胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤，据统计约占颅内肿瘤的12%～15%[1,2]。通常，患者确诊为GBM之后往往生存期较短。即便是经过手术或放、化疗等标准治疗后，平均生存期大约也只能延长12～15个月[3]。最近的实验研究已在GBM患者肿瘤组织中发现了一种特异性较强的细胞亚型，即：人胶质瘤干细胞(hGSCs)，其在GBM的发生、发展及恶性表型中扮演着极为重要的作用[4]。hGSCs具有较强的自我更新及复制的能力，致使GBM容易复发[5,6]。导致hGSCs产生耐药性的因素很多，最先发现的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(MGMT)的表达量和替莫唑胺(TMZ)的耐药性有着密切的关联[7,8]。YKL-40为一种分泌性的糖蛋白，其在中枢神经系统恶性肿瘤患者血清及实体瘤组织中高表达[9]。研究表明，YKL-40在中枢神经系统恶性肿瘤的发生、发展和侵袭性过程中发挥了重要的作用[10,11]。然而我们对于hGSCs潜在的恶性表型机制及化疗药物抑制能力的认知还有限，本文重点研究MGMT高表达状态下YKL-40表达水平对hGSCs干性的影响。对hGSCs分子生物学特性及表观遗传学的研究可能会在很大程度上推动对胶质瘤的认知，并能有效地促进临床治疗的进步。

材料与方法

一、主要试剂与设备

胰酶(Trypsin)、脱氧核糖核酸酶I(DnaseI)、Neurobasal培养基、B27干细胞培养因子、N2干细胞培养因子、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及胎牛血清(Fetal bovine serum)均购于Gibco公司；细胞滤网(Nylon公司,美国)、YKL-40单克隆抗体、MGMT单克隆抗体、Nestin单克隆抗体、Olig2单克隆抗体、Vimentin单克隆抗体及β-tubulin单克隆抗体(R and D System公司,美国)、二抗(中衫金桥公司,中国)、RNAiso Plus(Takara公司,日本)、RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,美国)、SYBR®PremixExTaqTMII(Takara公司,日本)、荧光二抗、DAPI(Bio-Rad公司,美国)和Cell Proliferation ELISA、BrdU试剂盒(Roche公司,美国)。

二、方法

1.hGSCs的分离及培养：将手术切除的GBM肿瘤标本行机械性分割为2 mm大小的组织块，加入适量Trypsin和10 U/ml的DNasel，在37℃孵箱中消化45 min。离心后经数次HBSS清洗，经过100 um的细胞滤筛过滤，将滤过后的细胞置于EF培养液(包含3 mmol/L L-Glutamine、1×B27 supplement、0.5×N2 supplement、2 ug/ml heparin、20 ng/ml recombinant human EGF、20 ng/ml recombinant human FGF、1×penicillin)中培养。

2.Western blot：收集各组hGSCs对照组及病毒组细胞，提取总蛋白。行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜条件为100 V，1.5 h。转膜后用新鲜配制的5%脱脂奶粉于室温下封闭90 min。加入山羊抗人YKL-40单克隆抗体(1∶250)、鼠抗人MGMT单克隆抗体(1∶1 000)、鼠抗人Nestin单克隆抗体(1∶1 000)、兔抗人OLIG2单克隆抗体(1∶500)、兔抗人Vimentin单克隆抗体(1∶1 000)及兔抗人β-tubulin单克隆抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜。弃去一抗后，1% TBST清洗，加入辣根过氧化物酶标记 (horseadish peroxidase-conjugated,HRP ) 的抗鼠、抗兔或抗山羊的二抗，室温孵育1 h。TBST清洗后，加入发光液，成像拍照。

3.Real-time PCR：收集各组hGSCs及对照组与病毒组细胞，TRIzol法提取总RNA。将mRNA按First Strand cDNA synthesis Kit说明书步骤反转为cDNA。Real-time PCR反应条件为：起始变性 95℃ 3 min；变性 95℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，延伸 72℃ 45 s，循环 40 次；最后延伸 72℃ 10 min。所用引物序列如下：

human YKL-40 sense:5'-TGCAGCCAGAATGGGTGT-3',antisense:5'-CTGGTGTAGTAGCAGACCAGTTTGT-3';human CD133 sense:5'-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3',antisense:5'-CTCCGAATCCATTCGACGATA-3';human Olig2 sense:5'-TCGGAGCGAGCTCCTCAAAT-3',antisense:5'-GGGAAGATAGTCGTCGCAGCTT-3';human Vimentin sense:5'-TGACATTGAGATTGCCACCTACAG-3',antisense:5'-TCAACCGTCTTAATCAGAAGTGTCC-3'.human GAPDH sense 5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3'antisense 5'-TAAGCAGTTGGTGGTGCAGG-3'.

上述引物均由上海宝生生物工程技术服务有限公司生产。

4.细胞免疫荧光染色：将各组hGSCs按2×105/ml种植于多聚赖氨酸包被过的6孔板玻片上，加入EF培养液400 ul，24 h后胶质瘤干细胞均粘附于玻片上，弃去培养液，PBS清洗。经4%的多聚甲醛(PFA)室温固定15 min后，弃去多聚甲醛，PBS清洗。加入一抗稀释液(含0.3%Triton-X100、5%BSA、一抗)，4℃孵育过夜。弃去一抗稀释液，PBS清洗。加入荧光二抗，避光室温孵育1 h，弃去二抗，PBS清洗。加入DAPI(1∶5 000)细胞核染色10 min，弃去DAPI染色液，PBS清洗。抗淬灭剂封片后于荧光显微镜下观察并拍照。

5.YKL-40过表达及shRNA慢病毒包装及感染hGSCs：将各组hGSCs克隆球分离为单个细胞后，取2×105单细胞种植于含2 ml的EF培养液6 cm皿中，加入适宜低度的病毒液和5 mg/ml的内质体，混合均匀后培养5～7 d，于3 d后加EF培养液0.5 ml，7 d后观察荧光反应，明确病毒感染效率。

6.单细胞克隆球形成实验：将各组hGSCs克隆球分离为单细胞后，用红细胞计数器进行细胞计数，以倍比稀释法将原细胞悬液稀释为1×103/ml，种植于96孔板中，每孔100 ul，每组8个复孔。7 d后添加EF培养液100 ul。14 d后镜下计数单细胞克隆球的形成数量。

7.细胞增值实验：将各组hGSCs克隆球分离为单细胞后，种植于96孔板中，每组3个复孔，每孔1×105个细胞并加入100 ul EF培养液。实验过程均按Cell Proliferation ELISA,BrdU (colorimetric) Kit说明书操作，加入25 ul 1M H2SO4后终止反应，经酶标仪检测450 nm波长处OD值。

8.统计学分析：采用SPSS 13.0软件包进行分析，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析法，即one-way ANOVA进行差异性统计，使用Tukey检验进行组间检验、校正。所有数据比较，Plt;0.05认为有统计学差异。

图1 克隆球染色
Fig 1 Staining of spheres
A:The spheres of human glioma stem cells (×200); B,C:The fluorescence staining of Nestin and CD133 (×400); D,E:The fluorescence staining of GFAP and Tubulin III after serum-induced differentiation ( ×400).

图2 人胶质瘤干细胞中MGMT的表达量
Fig 2 The expression of MGMT in human glioma stem cells

图3 人胶质瘤干细胞病毒组与对照组中细胞增值能力比较
Fig 3 Comparison of the cell proliferation ability between virus and control groups

aPlt;0.05,vscontrol groups.

图4 人胶质瘤干细胞病毒组与对照组中干性表达比较
Fig 4 Comparison of the stemness between the virus and the control groups

A：The expression of mRNA between the virus and the control groups； B：The blot image of the expression of stemness between virus and control groups

aPlt;0.05,vscontrol groups.

结 果

一、hGSCs的分离培养及鉴定

将临床上收集的hGSCs组织标本进行分离、培养。在适宜于胶质瘤干细胞分选的培养条件下，7 d内肿瘤组织标本可以形成典型的神经球样结构。成功分离、培养了三株可稳定传代超过6个月的hGSCs。经细胞免疫荧光染色表明，此三株肿瘤干细胞皆表达Nestin及CD133。加入10%的血清后，神经球样结构分化为贴壁细胞、且表达胶质细胞活化的典型标志物GFAP及神经元的典型标志物tubulinIII。上述结果证明，从肿瘤组织样本中分离、培养的神经球样结构即为肿瘤干细胞，并具有多向分化潜能(图1)。

二、hGSCs中MGMT蛋白表达水平

用Western blot 法检测三株hGSCs中MGMT蛋白的表达水平，结果表明，WZ12、WZ27、WZ31均为MGMT阳性表达(图2)。因而，将此三株hGSCs作为我们选择的研究对象。

三、慢病毒感染后对hGSCs单细胞克隆球形成能力的影响

分别检测了原代、第二代、第三代的各株hGSCs病毒组与对照组单细胞克隆球形成能力。结果显示，WZ12在上调YKL-40后、其克隆球形成能力有所增强(Plt;0.05)；而在WZ27和WZ31这两株hGSCs中，当YKL-40下调后、其克隆球形成能力明显减弱(Plt;0.05)。

四、慢病毒感染后对hGSCs体外增值能力的影响

各hGSCs病毒组与对照组的Brdu实验结果显示(图3)：WZ12过表达YKL-40后，其增值能力提高(Plt;0.05)；而WZ27、WZ31敲除YKL-40后，其增值能力则降低(Plt;0.05)。

五、慢病毒感染后对hGSCs干性的影响

RT-PCR实验检测了病毒感染各株hGSCs后干性指标CD133、Vimentin、olig2的变化(图4A)表明：WZ12病毒感染后、其干性指标均升高(Plt;0.05)；WZ27、WZ31病毒感染后、其干性指标均下降(Plt;0.05)。Western blot实验同时检测了hGSCs感染病毒后干性指标Nestin、Vimentin、olig2的改变(Plt;0.05)(图4B)提示：其干各株hGSCs干性指标的变化与RT-PCR的结果一致。

讨 论

干细胞和肿瘤细胞都具有这样自我更新的特性。干细胞的干性主要表现为细胞的自我复制和多项分化潜能，这种能力维持了细胞的繁衍以及多样性[12]。然而在GBM中，hGSCs因其自我更新、多项分化及药物抑制性等特点，在基础和临床研究中广受重视。hGSCs干性的维持是其上述特性的基础。在常规的GBM治疗中，我们只是针对实体的肿瘤，寄希望于尽可能的将肿瘤切除干净或应用放、化疗以缩小肿瘤体积，但是往往忽略了肿瘤来源的根本。如果不能有效地抑制hGSCs的作用，很可能会导致GBM的迅速复发。YKL-40作为一多种属来源、高度保守的蛋白，参与了细胞的增殖、分化、凋亡、血管生成及组织重构等过程。其表达水平与肿瘤的分级呈正相关，并参与了中枢神经系统恶性肿瘤的演进过程。最新研究表明，YKL-40在肿瘤干细胞干性维持等生物学特性中发挥了重要作用。在本研究中，为明确YKL-40对GSCs干性的作用，我们应用shRNA慢病毒感染的方法，下调或上调hGSCs中YKL-40的表达量，体外实验中证实了hGSCs的“干性”与YKL-40的表达水平呈正相关关系。本研究证明了YKL-40在hGSCs干性维持的过程中扮演了重要角色。YKL-40可能作为GBM手术后分子靶向治疗的关键靶点及成为GBM判断预后的指标之一。MGMT系一种DNA修复蛋白，它可以直接通过将烷基化的结构域转移至其内在的半胱氨酸残基的活化位点上，从而恢复O6烷基化鸟嘌呤位点结构的完整性。基础医学及临床医学的证据显示，MGMT的表达量主要受表观遗传学中的启动子之甲基化调控。通常情况下，涵盖MGMT基因启动子和外显子较多部分的CpG岛是处于甲基化状态的[13,14]，但是在一些中枢神经系统肿瘤细胞、尤其是hGSCs中，CpG岛中的胞嘧啶发生去甲基化，进而导致了转录因子的过度结合，最终使MGMT蛋白表达量升高，以及瘤细胞对烷化剂化疗药物敏感性降低。本实验是基于MGMT高表达的hGSCs为研究对象的，而MGMT低表达状态下YKL-40对hGSCs的调控作用又是如何？尚需进一步研究。

1Stupp R,Hegi ME,Mason WP,et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study:5-year analysis of the EORTC-NCIC trial [J]. Lancet Oncol,2009,10(5):459-466.

2DeAngelis LM. Brain tumors [J]. N Engl J Med,2001,344(2):114-123.

3Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma [J]. N Engl J Med,2005,352(10):987-996.

4Stopschinski BE,Beier CP,Beier D,et al. Glioblastoma cancer stem cells--from concept to clinical application [J]. Cancer Lett,2013,338(1):32-40.

5Auffinger B,Spencer D,Pytel P,et al. The role of glioma stem cells in chemotherapy resistance and glioblastoma multiforme recurrence [J]. Expert Rev Neurother,2015,15(7):741-752.

6Eramo A,Ricci-Vitiani L,Zeuner A,et al. Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells [J]. Cell Death Differ,2006,13(7):1238-1241.

7Zacher A,Kaulich K,Stepanow S,et al. Molecular diagnostics of gliomas using next generation sequencing of a glioma-tailored gene panel [J]. Brain Pathol,2016,Feb 25. doi:10. 1111/bpa. 12367. [Epub ahead of print].

8Riemenschneider MJ,Hegi ME,Reifenberger G,et al. MGMT promoter methylation in malignant gliomas [J]. Target Oncol,2010,5(3):161-165.

9Bernardi D,Padoan A,Ballin A,et al. Serum YKL-40 following resection for cerebral glioblastoma [J]. J Neurooncol,2012,107(2):299-305.

10Zhang W,Kawanishi M,Miyake K,et al. Association between YKL-40 and adult primary astrocytoma [J]. Cancer,2010,116(11):2688-2697.

11Zhang W,Muran K,Zhang K,et al. Resveratrol represses YKL-40 expression in human glioma U87 cells [J]. BMC Cancer,2010,10:593.

12李光辉,陈正堂,尹昌林,等. 人胶质瘤干细胞内在自我更新能力 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2007,6(3):210-2013.

13Christians A,Hartmann C,Benner A,et al. Prognostic value of three different methods of MGMT promoter methylation analysis in a prospective trial on newly diagnosed glioblastom [J]. PLoS One,2012,7(3):e33449.

14Hegi ME,Liu L,Herman JG,et al. Correlation of O6-methylguanine methyltransferase (MGMT) promoter methylation with clinical outcomes in glioblastoma and clinical strategies to modulate MGMT activity [J]. J Clin Oncol,2008,26(25):4189-4199.

EffectofYKL-40onthe"stemness"ofhumangliomastemcellswithhighexpressionofMGMT

CHENWeijun,ZHANGWei,ZHANGXiang

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710032,China

ObjectiveThe effect of YKL-40 on the stemness of human glioma stem cells (hGSCs) with high expression of MGMT was investigated.MethodsThe hGSCs were isolated and identified from clinical glioblastoma specimen. After confirming the transduction effect of hGSCs with YKL-40 lentivirus,single cell sphere formation assay,cell proliferation assay,RT-PCR and Western blot analysis were used to detect the expression of "stemness" markers and the changes of biological function in hGSCs.ResultsMGMT protein was highly expressed in all the selected hGSCs. Single cell formation,cell proliferation and "stemness" of hGSCs with highly expressed YKL-40 were better than those of hGSCs with lower expression of YKL-40.ConclusionYKL-40 plays an important role in the process of "stemness" maintenance,and it might be the key target for the molecular therapy after clinical surgery,however,it can also provide new clinical ideas for the diagnosis and treatment of glioblastoma multiforme.

Glioblastoma multiforme; Cancer stem cell; YKL-40; MGMT

1671-2897(2016)15-309-04

R 739

A

国家自然科学基金资助项目( 81302174)

陈蔚军，博士研究生，E-mail：chenweijun0920@126.com

*通讯作者：章薇，讲师、主治医师、硕士生导师，E-mail:nuomi_weiwei@126.com；章翔，教授、主任医师，博士生导师， E-mail：xzhang@fmmu.edu.cn

2016-06-07；

2016-07-20)