气相色谱法测定蝉花中角鲨烯的含量

凡军民， 贾 君，谢春芹， 韩艳丽

(江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400)



气相色谱法测定蝉花中角鲨烯的含量

凡军民， 贾 君*，谢春芹， 韩艳丽

(江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400)

[目的]建立毛细管气相色谱(GC)测定蝉花中角鲨烯含量的方法。[方法]采用气相色谱法测定蝉花中角鲨烯，并对不同部位天然蝉花的角鲨烯含量进行比较，确定蝉花中角鲨烯含量测定的最佳条件。[结果]1 g蝉花经超声波提取后，经1 mL 0.5 mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液40 ℃皂化5 min，再经正已烷萃取净化，采用GC法测定角鲨烯含量。该方法在角鲨烯质量浓度为21.43～214.30 μg/mL(r=0.999 2) 范围内线性关系良好，方法精密度良好(RSD=3.71%)，加标回收率为77.80%～97.32%，平均加标回收率(n=9)为88.10%。[结论]气相色谱法简单快速，污染小，检测灵敏度高，可用于蝉花中角鲨烯含量的测定。

蝉花；角鲨烯；气相色谱法

蝉花(CordycepscicadaeShing)是一些蝉的土栖若虫受到蝉拟青霉(PaecilomyescicadaeSamson)真菌寄生的产物，与名贵中药材冬虫夏草的无性系同属，金蝉花可以作为冬虫夏草的代用品，起到滋补养生的作用[1]。研究表明，蝉花含有多种活性成分，具有调节免疫功能和脂类代谢，改善机体的营养状况，抗疲劳、解热镇痛和滋补强壮等作用[2]。

角鲨烯又名鲨烯、鲨萜，是所有细胞中甾醇的前体，不饱和程度较高，是一种非常重要的功能油脂[2-3]。角鲨烯具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、抗心血管疾病、抗感染、提高免疫调节等多种生理功能[4]，因此被广泛应用于保健食品、医药及化妆品等行业。目前，角鲨烯含量的测定方法主要有气相色谱法(GC)[5-6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[7-8]、高效液相色谱法(HPLC)[9-10]以及超高效液相色谱法(UPLC)[11-12]。由于角鲨烯的极性较小，易溶解于非极性溶剂中，故检出限均高于气相色谱和气质联用色谱法而很少被应用于分析检测中。气相色谱法测定中大多数采用有机溶剂溶解直接进样，不仅污染了色谱柱，还缩短了色谱柱的使用寿命。由于角鲨烯是一种脂质不皂化物，因此可对样品进行皂化前处理，然后萃取净化皂化液，从而可脱除样品中较多的杂质峰。笔者建立了气相色谱法测定蝉花中角鲨烯的色谱条件，并对不同部位天然蝉花的角鲨烯含量进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂。蝉花(CordycepscicadaeShing)产自江苏省句容市磨盘山；角鲨烯对照品(含量99.5%)，中国药品生物制品检定所，批号140721-200601；正己烷为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备。Agilent 7890A-FID气相色谱仪，MD 200氮气吹扫仪，梅特勒-托利多ME204E 电子天平，艾本森MixPuls涡旋混合仪，KH5200型超声波清洗器，DJ-04B型粉碎机。

1.2 方法

1.2.1 对照品储备液的制备。精密称取角鲨烯对照品适量，置50 mL容量瓶中，加正己烷溶解稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为214.30 mg/mL的对照储备液。

1.2.2 供试溶液的制备。精密称定烘干至恒重的样品粉末约1 g，置于50 mL离心管中，加正己烷20 mL，在40 kHz、200 W条件下超声提取30 min，冷却后过滤，将滤液用氮气吹干。在吹干的蝉花脂肪酸中加入0.5 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液 1.0 mL，摇匀，40 ℃水浴加热5 min，取出冷却，加入正己烷2.0 mL萃取，静置 10 min，取上清液，过 0.22 μm滤膜，作为供试溶液，备用。

1.2.3 气相色谱条件。采用Agilent HP-5毛细管色谱柱(30.00 m × 0.32 mm × 0.25 μm，Agilent Technologies)，载气为氮气(纯度 99.999%)；空气流速400 mL/min，氢气流速30 mL/min，氮气流速2 mL/min；检测器FID温度为290 ℃，进样口温度为280 ℃，进样量为1 μL，分流比为10∶1；程序升温：初始温度180 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升温至250 ℃，保持10 min。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化 采用超声、索氏2种方法进行提取，蝉花中角鲨烯质量百分含量相当，索氏提取法较繁琐、加热回流时间较长，因此选择超声提取。参照 GB/T 22110—2008，采用正己烷作为提取溶剂，对蝉花(1 g)提取油进行甲酯化条件的选优，结果表明，皂化温度40 ℃，皂化时间5 min，氢氧化钠-甲醇浓度0.5 mol/L，加入量1.0 mL为最佳皂化反应条件。

2.2 色谱条件的选择 由于角鲨烯易溶于非极性溶剂，一般采用非极性色谱柱用于角鲨烯的分离和测定，因此该试验采用非极性色谱柱 HP-5耐高温低流失毛细管柱。角鲨烯沸点高、难挥发，出峰时间较晚，因此采用180 ℃柱温作为初始温度，并在较文献[9]低的温度250 ℃下保持10 min，结果减少了角鲨烯检测时间，色谱峰的分离效果好且基线较平稳。在此色谱条件下，角鲨烯标准品与样品的色谱图见图1。

图1 角鲨烯对照品(A)、蝉花(B)的GC色谱Fig.1 Gas chromatography of squalene reference substances (A) and C.cicadae (B)

2.3 方法学评价

2.3.1 线性关系考察。分别精密移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL对照储备液，用正己烷定容于2 mL容量瓶中，摇匀，得各浓度对照品溶液，按“2.2”色谱条件测定。以角鲨烯质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得到回归方程Y=2.038 9X+4.123 2 (r=0.999 2，n=6)，结果表明角鲨烯质量浓度在21.43～214.30 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.2 精密度试验。取同一对照品溶液按“1.2.3”色谱条件测定，连续进样 6 次，计算峰面积相对标准偏差，RSD为1.15% (n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验。取蝉花粉6份，按“1.2.2”方法制备供试溶液，按“1.2.3”色谱条件测定，根据标准曲线计算角鲨烯的含量，得角鲨烯的平均质量分数为28.00 μg/g，RSD为3.71% (n=6)，结果表明制备方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验。取同一供试溶液按“1.2.3”色谱条件测定，每隔2 h进样1次，共进样7次，计算峰面积相对标准偏差，RSD为3.23%(n=7)，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.5 回收率试验。精密称取同一批蝉花粉样品约1 g，共9 份，分别精确加入42.86 μg/mL角鲨烯对照品溶液1.00、1.50、2.00 mL 各 3 份，按“1.2.2”方法制备供试溶液，得出角鲨烯的平均回收率为88.10%(n=9)，结果见表 1。

表1 加标回收率试验结果(n=9)

2.4 样品中角鲨烯含量测定 采用“1.2.2”方法制备供试溶液，按“1.2.3”色谱条件测定，根据标准曲线计算角鲨烯的含量，测定结果得出，天然蝉花和蝉花虫体中角鲨烯含量分别为(26.67±0.57)、(49.61±0.38)μg/g,蝉花子座中未检出角鲨烯。由此可以看出，蝉花子座中角鲨烯含量极其微少或不存在。天然蝉花复合体由子座和虫体2部分构成，蝉花虫体中的角鲨烯含量大于子座，说明角鲨烯在天然蝉花中分布是不均匀的。

3 结论与讨论

该试验采用的方法测定天然蝉花中角鲨烯含量为(27.76±0.57) μg/g，与卫亚丽等[5]测定结果(74.36±0.24)μg/g的差异较大。蝉花角鲨烯含量差异的原因，可能一方面与蝉花的产地有关，另一方面与角鲨烯的提取方法有关。具体的提取方法还有待进一步研究。

该研究建立了毛细管气相色谱测定蝉花的角鲨烯含量的方法，升温程序简单，样品分析时间短，重复性好，灵敏度高，角鲨烯色谱峰分离效果好，经过不同样品测定，定量准确，故此方法可以用于蝉花中角鲨烯含量的测定。

[1] 王琼，王春雷，何福根,等.地方药材金蝉花的研究进展[J].肿瘤学杂志,2013,19(3):227-230.

[2] 官波,郑文诚.功能性脂质——角鲨烯提取纯化及其应用[J].粮油食品科技,2010,18(4):27-30.

[3] NAZIRI E,TSIMIDOU M Z.Formulated squalene for food related applications[J].Recent Pat Food Nutr Agric,2013,5(2):83-104.

[4] 王宝琴，任丽丽.角鲨烯的来源及其制备方法研究进展[J].食品研究与开发,2015,36(21):193-197.

[5] 卫亚丽,杨茂发,刘爱英,等.毛细管气相色谱法测定中药蝉花中角鲨烯的含量[J].药物分析杂志,2014,34(11):1975-1978.

[6] 王李平,林晨,蔡大川,等.气相色谱法测定茶油中角鲨烯的含量[J].食品工业,2015,36(2):284-286.

[7] 汪运明,陈华勇,杨继国,等.气相色谱质谱联用测定茶油中角鲨烯含量[J].食品工业科技,2011,32(6):404-406.

[8] 石金娥,于海玲,王岩,等.气相色谱-质谱联用测定南瓜籽油中角鲨烯的含量[J].中国油脂,2014,39(11):88-91.

[9] 陈伟珠,晋文慧,张怡评,等.角鲨烯的高效液相色谱检测法[J].食品研究与开发,2015,36(24):131-134.

[10] 张欣,于瑞祥,杨瑞钰,等.植物油中角鲨烯的提取与高效液相色谱法分析[J].中国粮油学报,2013,28(5):96-99.

[11] 陈伟珠,方华,张怡评,等.超高效液相色谱法检测角鲨烯[J].食品与发酵科技,2014,50(6):74-77.

[12] 荣维广,刘华良,李莉,等.超高效液相色谱法测定保健食品中角鲨烯[J].预防医学情报杂志,2013,29(8):734-736.

Determination of Squalene in Cordyceps cicadae Shing by Gas Chromatography

FAN Jun-min,JIA Jun*,XIE Chun-qin et al

(Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry,Jurong,Jiangsu 212400)

[Objective] To establish a method of capillary gas chromatography to detect the content of squalene inCordycepscicadae.[Method] Squalene inCordycepscicadaeShing was detected by gas chromatography.And the squalene contents in different parts ofC.cicadaewere compared.The optimal condition for the detection of squalene inC.cicadaewas obtained.[Result]C.cicadae(1 g) was extracted by ultrasonic extraction,the product was methyl esterified at 40 ℃ for 5 min by 1 mL of 0.5 mol/L sodium hydroxide-methanol solution and then extracted by n-hexane.The squalene could be determined quantitatively by GC.When the squalene concentration was from 21.43 to 214.30 μg/mL,there was a good linear relation (r=0.999 2) and a perfect method precision (RSD= 3.71%),and the recovery rate was 77.80%-97.32%,and the average recovery rate was 88.10% (n=9).[Conclusion] This method was simple and rapid with low pollution and high sensitivity,and it is suitable for determination of squalene content inC.cicadae.

CordycepscicadaeShing; Squalene; Gas chromatography

江苏农林职业技术学院科研基金项目(2015kj034)；创新团队科研基金项目(2014td002)。

凡军民(1977- )，女，湖北荆州人，副教授，博士，从事食品及相关产品的检测研究。*通讯作者，教授，博士，从事食品检测研究。

2016-07-29

TS 201.2

A

0517-6611(2016)28-0094-02