GDF11对ApoE-/-糖尿病小鼠内皮依赖性血管舒张功能的作用

梅稳 向光大 卢俊颜 李欢 向林 董靖

基础研究

·论著·

GDF11对ApoE-/-糖尿病小鼠内皮依赖性血管舒张功能的作用

梅稳 向光大 卢俊颜 李欢 向林 董靖

目的研究生长分化因子11(GDF11)对载脂蛋白 E 基因敲除(ApoE-/-)糖尿病小鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能的影响，探讨其可能的机制。方法40只4周龄健康雄性ApoE-/-小鼠按随机数字法选择10只作为正常对照组(NC组)，以正常饲料喂养，其余30只以高脂饲料喂养4周后,连续5 d腹腔注射链脲佐菌素(50 mg/kg)制备2型糖尿病模型。将造模成功小鼠共20只按随机数字法分为GDF11组(0.1 mg·kg-1·d-1腹腔注射，n=10)和糖尿病对照组(T2DM组，等量磷酸盐缓冲液腹腔注射，n=10)。干预4周后，检测各组空腹血糖、空腹胰岛素、HbA1c、GDF11浓度，并计算稳态模型评估-胰岛素敏感性指数(HOMA-ISI)；测定各组小鼠离体胸主动脉条的张力反应及主动脉一氧化氮含量，Western印迹检测主动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷酸化eNOS(P-eNOS)、Smad2/3、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)水平。结果与NC组相比，T2DM组空腹血糖、空腹胰岛素、HbA1c水平升高，GDF11浓度及HOMA-ISI降低，乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张反应降低；与T2DM组相比，GDF11组上述指标均有改善(F=70.923～675.430，P均<0.01)。而硝普钠诱导的内皮非依赖性舒张反应各组间差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组相比，T2DM组血管中一氧化氮含量、P-eNOS水平、磷酸化Smad2/3水平下降，GDF11组上述指标均有显著升高(F=40.120～148.060，P均<0.01)。结论GDF11通过促进一氧化氮生成，激活Smad2/3信号通路，改善ApoE-/-糖尿病小鼠内皮依赖性血管舒张功能。

生长分化因子11；2型糖尿病；内皮依赖性血管舒张；一氧化氮

2型糖尿病(T2DM)与动脉粥样硬化(AS)关系密切，表现在患者出现AS的时间早、程度重、预后差。糖尿病能引起内皮功能紊乱，而内皮依赖性舒张功能紊乱是发生AS的一个早期标志，也是糖尿病多种血管并发症的病理基础[1]。生长分化因子11(GDF11)，又名骨形态发生蛋白11，属于转化生长因子-β超家族成员之一。GDF11是一种在早期胚胎发育过程中起重要作用的蛋白，对多种器官发育起调控作用[2-4]。最近的研究发现，GDF11可以恢复衰老小鼠的神经干细胞再生和分化潜能，增加老年小鼠大脑血管腔体积和血流量，这种作用是通过直接促进内皮细胞增殖实现的[5]。本研究使用高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导T2DM小鼠模型，并用GDF11进行干预，观察其对小鼠血管内皮依赖性舒张功能、一氧化氮浓度的影响，探讨GDF11的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂 高脂饲料购于北京华阜康公司。重组人GDF11(Pepro Tech公司)、STZ及去甲肾上腺素(Sigma公司)、血糖仪及试纸(强生公司)、胰岛素放射免疫检测试剂盒、HbA1c、GDF11 ELISA检测试剂盒(伊莱瑞特生物科技有限公司)、一氧化氮检测试剂盒(南京凯基)、氯化乙酰胆碱(上海阿拉丁公司)、一抗[单克隆兔抗人内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷酸化eNOS(P-eNOS)、Smad2/3、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)抗体]、二抗[单克隆山羊抗兔抗体(辣根过氧化物酶标记)，美国CST公司)]、BL-420S生物信号采集系统、JH-2型张力换能器及HV-4恒温灌流系统均购买于成都泰盟公司。

1.2 实验方法

1.2.1 T2DM小鼠模型的建立 40只4周龄的SPF级雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠[批号为SCXK(京)2014-0004]，按照随机数字法选择10只作为正常对照组(NC组)，予以普通饲料喂养。其余30只准备造模，予以高脂饲料喂养。4周后准备造模小鼠禁食12 h，连续5 d腹腔注射STZ(50 mg/kg)进行T2DM造模，NC组仅腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射1周后测腹腔葡萄糖耐量试验，以空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L为T2DM小鼠成模标准，共造模成功20只。

1.2.2 动物分组及干预 将造模成功的20只小鼠按照随机数字法分为糖尿病对照组(T2DM组，n=10)和GDF11组(n=10)，GDF11组根据小鼠体重每天给予0.1 mg·kg-1·d-1的GDF11，连续4周腹腔注射[5]。NC组和T2DM组每天予以等量的磷酸盐缓冲液腹腔注射。

1.2.3 各组小鼠体重、空腹血糖、空腹胰岛素、HbA1c和GDF11浓度的测定 记录各组小鼠第4，10，14周时的体重。14周实验结束时，尾部取血测血糖，腹腔注射1%戊巴比妥钠60 mg/kg麻醉小鼠，皮肤消毒后开腹，下腔静脉采血，离心后取血清，ELISA检测胰岛素、HbA1c和GDF11浓度。计算稳态模型评估-胰岛素敏感性指数(HOMA-ISI)=1/(空腹血糖×空腹胰岛素)。

1.2.4 离体胸主动脉内皮舒张功能测定 每组取其中5只采过血的小鼠，迅速开胸，剪除肺脏组织，在体式显微镜下移除主动脉血管鞘及周围结缔组织，每只小鼠取出4段胸主动脉环，每段长约4 mm，将血管环悬于挂钩，置于37℃持续通95%O2+5%CO2混合气体的Krebs液中。在含Krebs液的恒温灌流槽中，下方以钢钩固定于槽底，上方通过JH-2张力换能器连接BL-420S生物信号采集系统记录张力变化。调整基础静息张力0.5 g，平衡1 h。血管环张力平衡后，向浴槽中加入终浓度为10-6mol/L的苯肾上腺素收缩主动脉环，待其收缩张力达到平顶后，依次加入终浓度分别为1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6，1×10-5，1×10-4mol/L的乙酰胆碱诱导血管舒张，同步记录每一浓度下主动脉环张力的变化，取4个环的平均张力，各浓度的内皮依赖性舒张反应为[(最大张力-各浓度点张力)/(最大张力-基础值)]×100%。冲洗血管重新平衡至基础张力，换用浓度为10-9～10-4mol/L的硝普钠测定血管内皮非依赖性舒张功能。

1.2.5 主动脉一氧化氮含量、eNOS、P-eNOS、Smad2/3、P-Smad2/3表达水平检测 每组剩余5只采过血的小鼠，取其主动脉的一半，加入1∶10冷生理盐水，匀浆后离心，取上清液，按一氧化氮检测试剂盒步骤测定。另外一半主动脉于液氮中冻存备测Western印迹。测定时，主动脉匀浆，测蛋白浓度后，各样本取50 μg蛋白上样于12%的PAGE胶电泳，电泳后转膜于 0.2 μm的硝酸纤维素膜，室温摇床封闭2 h，然后用相应特异性一抗[抗eNOS、P-eNOS(Ser1177)、Smad2/3、P-Smad2/3抗体]和辣根过氧化物酶标记的二抗处理，最后用增强的化学发光剂染色、显影。

2 结果

2.1 各组体重、空腹血糖、空腹胰岛素和HbA1c的

比较 10周时，T2DM组体重低于NC组(F=4.635，P<0.05)；14周时T2DM组和GDF11组体重低于NC组，但各组体重差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组相比，GDF11组、T2DM组空腹血糖、空腹胰岛素、HbA1c均显著升高，HOMA-ISI显著下降(P均<0.01)。与T2DM组相比，GDF11组空腹血糖、空腹胰岛素、HbA1c均降低，HOMA-ISI上升(P均<0.01)，见图1，表1。

注：NC组：对照组；T2DM组：糖尿病对照组；GDF11组：GDF11干预组；GDF11：生长分化因子11；与NC组相比，aP<0.01图1 3组小鼠不同时间点体重的比较

2.2 各组GDF11浓度的比较 T2DM组血清GDF11浓度低于NC组，GDF11组血清GDF11浓度高于T2DM组，但仍低于NC组[NC组：(220.71±6.83) ng/L；T2DM组：(147.46±4.92) ng/L；GDF11组：(206.47±7.03) ng/L，F=675.430，P<0.01]。

2.3 GDF11对乙酰胆碱诱导的主动脉内皮依赖性舒张功能的影响 与NC组相比，T2DM组小鼠胸主动脉对乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应显著下降[(92.32±2.17)%vs. 60.03±3.07)%，乙酰胆碱：10-4mmol/L，F=590.380，P<0.01]，而对硝普钠诱导的内皮非依赖性舒张功能，差异无统计学意义；

表1 3组小鼠14周时空腹血糖、空腹胰岛素、HbA1c和HOMA-ISI的比较

注：NC组：对照组；T2DM组：糖尿病对照组；GDF11组：GDF11干预组；GDF11：生长分化因子11；与NC组相比，aP<0.01，与T2DM组相比，bP<0.01；FPG:空腹血糖；FINS：空腹胰岛素；HOMA-ISI：稳态模型评估-胰岛素敏感性指数

与T2DM组相比，GDF11组上述指标得到改善[(80.85±3.26)%vs.(60.03±3.07)%，乙酰胆碱:10-4mmol/L，F=179.240，P<0.01]，对硝普钠诱导的舒张反应差异仍无统计学意义[(93.31±4.13)%vs.(89.23±3.83)%vs.(90.59±3.27)%，硝普钠：10-4mmol/L，F=1.365，P>0.05]，见图2。

2.4 各组小鼠主动脉一氧化氮含量和Western印迹结果 与NC组相比，T2DM组、GDF11组离体主动脉一氧化氮含量显著下降[NC组：(118.31±7.21) μmol/mg；T2DM组：(68.31±5.17) μmol/mg；GDF11组：(95.07±4.02) μmol/mg，P<0.01]；与T2DM组相比，GDF11组一氧化氮含量显著升高(F=148.060，P<0.01)。Western印迹结果显示，与NC组相比，T2DM组P-eNOS/eNOS水平显著降低(P<0.01)，而GDF11组P-eNOS/eNOS水平显著高于T2DM组，但低于NC组(F=40.123，P<0.01)，见图3。与NC组和T2DM组相比，GDF11组P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3水平显著升高(P<0.01)，而T2DM组P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3水平又显著低于NC组(F=48.472，50.957，P均<0.01)，见图4。

注：NC组：对照组；T2DM组：糖尿病对照组；GDF11组：GDF11干预组；GDF11：生长分化因子11；Ach：乙酰胆碱；SNP：硝普钠；与NC组相比，aP<0.05；与T2DM组相比，bP<0.05图2 3组小鼠主动脉对不同浓度Ach和SNP介导的血管舒张反应

注：NC组：对照组；T2DM组：糖尿病对照组；GDF11组：GDF11干预组；GDF11：生长分化因子11；eNOS：内皮型一氧化氮合酶；P-eNOS：磷酸化内皮型一氧化氮合酶；与T2DM组、GDF11组相比，aP<0.01；与T2DM组相比，bP<0.01图3 GDF11对主动脉eNOS蛋白表达的影响

3 讨论

本研究提示，通过高脂饮食联合小剂量STZ进行T2DM造模，可以观察到T2DM组空腹血糖、空腹胰岛素和HbA1c水平较NC组明显上升，HOMA-ISI明显下降，提示胰岛素抵抗明显。胰岛素抵抗是糖尿病患者发生AS的独立危险因素。胰岛素抵抗可引起“糖毒性”、“脂毒性”及血管内皮功能障碍，加速AS进展[6]。研究观察到GDF11干预ApoE-/-糖尿病小鼠后，不仅空腹血糖、胰岛素和HbA1c较T2DM组有不同程度的下降，HOMA-ISI也有所改善，显示GDF11可以改善T2DM小鼠糖代谢水平，减轻胰岛素抵抗。因此，减轻胰岛素抵抗可能是GDF11改善血管内皮功能障碍的机制之一。

血管内皮功能障碍是包括AS在内的多种心血管疾病的早期病理生理改变[7]。通过测定以内皮依赖性舒张功能为代表的内皮功能，可早期预测疾病发生的风险及预后。同时它也可以用来评估药物是否具有心血管保护作用。本研究中，各组间非内皮依赖性舒张功能无明显区别，说明血管对乙酰胆碱引起舒张反应的差异是由内皮功能不同引起的。T2DM组内皮依赖性舒张功能下降，GDF11组内皮依赖性舒张功能得到改善，说明GDF11保护了血管内皮，即具有潜在的心血管保护作用。

注：NC组：对照组；T2DM组：糖尿病对照组；GDF11组：GDF11干预组；GDF11：生长分化因子11；与NC组相比，aP<0.01；与NC组和T2DM组相比，bP<0.01图4 GDF11对主动脉Smad2/3蛋白表达的影响

在体内，调节内皮依赖性舒张功能的重要介质是一氧化氮，它是以左旋精氨酸为底物，由eNOS催化合成的[8]。eNOS主要在动、静脉内皮细胞表达，多种化学物质和病理生理刺激如乙酰胆碱、血管内皮生长因子、血糖、血脂等，参与调节eNOS的活性，从而影响一氧化氮的产生。一氧化氮对血管的正常功能起重要作用，调节内皮细胞的舒张、增殖、衰老和凋亡，还具有防止AS的作用[9-10]。本研究中，T2DM组的主动脉P-eNOS/eNOS下降，一氧化氮含量降低是导致其内皮功能障碍的主要原因。体内给予重组GDF11蛋白后，上调了eNOS的活性、增加了一氧化氮的产生，进一步证实了GDF11对糖尿病血管并发症的保护作用。

GDF11实现多种生物学功能的基础是先与胞膜上活动素ⅡA和ⅡB型受体结合，再磷酸化Ⅰ型受体ALK5，形成配体受体复合物作用于胞浆内的Smad2/3蛋白，活化的Smad2/3蛋白与通用型Smad4结合形成复合物，转移至细胞核，调节基因的转录、翻译和表达[11-12]。最近的研究指出，衰老小鼠血清GDF11水平下降，它能增加小鼠大脑血管体积和分支数，体外实验发现GDF11能够促进大脑毛细血管内皮细胞增殖，并且这种作用是通过磷酸化Smad2/3通路实现的[5,13]。此外，一个8.9年的随访研究发现，在稳定性冠心病患者中，血清GDF11水平低的患者发生心血管事件(如心肌梗死、卒中、心力衰竭入院、死亡)的风险高，说明GDF11对冠心病患者具有一定的保护作用[14-15]。本研究采用高脂饮食联合STZ制备T2DM模型，发现造模后，血清GDF11水平下降。T2DM小鼠外源性补充GDF11后，主动脉磷酸化Smad2、磷酸化Smad3水平升高，说明激活了血管内皮的Smad2/3通路，Smad2/3蛋白与Smad4蛋白结合转移至细胞核，调节多种基因包括eNOS基因的表达，从而保护了血管内皮。

综上所述，本研究证实GDF11可改善ApoE-/-糖尿病小鼠的内皮依赖性舒张功能，其机制是减轻胰岛素抵抗、上调eNOS活性、增加一氧化氮浓度和激活Smad通路。但GDF11蛋白对多种心血管疾病的具体作用和相关机制还需进一步研究。

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EffectsofGDF11onendothelium-dependentvasodiationfunctionofaortainApoE-/-diabeticmice

MeiWen*,XiangGuangda,LuJunyan,LiHuan,XiangLin,DongJing.

*WuhanClinicalInstituteAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Correspondingauthor:XiangGuangda,Email:Guangda64@hotmail.com

ObjectiveTo explore the effects of growth differentiation factor 11 (GDF11) on endothelium-dependent vasodilation function of aorta in apolipoprotein E-Null (ApoE-/-) diabetic mice and to investigate the mechanisms.MethodsTen of the 40 healthy male ApoE-/-mice at 4-week age were selected as normal control group according to random number method and

basic diet, whereas the other 30 mice were fed with high-fat diet for 4 weeks and then treated with streptozotocin intraperitoneal injection (50 mg/kg) for 5 days to induce type 2 diabetes mellitus (T2DM). Diabetes was successfully induced in twenty mice which were then randomly divided into GDF11 group (0.1 mg·kg-1·d-1intraperitoneal injection,n=10) and T2DM control group (T2DM group, equivalent phosphate buffered saline,n=10) according to random number method. After 4 weeks of intervention, fasting plasma glucose, fasting plasma insulin, HbA1c and serum GDF11 were measured respectively. Homeostasis model assessment-insulin sensitive index (HOMA-ISI) was calculated. The relaxation response and nitric oxide levels were detected in isolated aorta of mice. Acetylcholine (Ach)-induced endothelium-dependent vasodilation and sodium nitroprusside (SNP) -induced endothelium-independent vasodilation were measured in aortas for estimating endothelial function. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS), phosphorylated eNOS (P-eNOS) and Smad2/3, phosphorylated Smad2/3 (P-Smad2/3) were measured by Western blotting in isolated aorta of mice.ResultsCompared with NC group, fasting plasma glucose, fasting plasma insulin, and HbA1c were significantly increased, meanwhile HOMA-ISI, serum GDF11 concentration and Ach-dependent relaxation response were significantly reduced in T2DM group; compared with T2DM group, all markers mentioned above were improved in GDF11 group (F=70.923-675.430, allP<0.01); whereas the SNP-independent relaxation were not different among three groups (P>0.05). Compared with NC group, nitric oxide, P-eNOS, P-Smad2/3 were significantly decreased in T2DM group, but indexes mentioned above were all increased in GDF11 group (F=40.120-148.060, allP<0.01).ConclusionGDF11 improves endothelium-dependent vasodilation function in ApoE-/-diabetic mice by enhancing nitric oxide synthesis and Smad2/3 signaling pathways.

Growth differentiation factor 11;Type 2 diabetes mellitus; Endothelium-dependent vasodilation; Nitric oxide

国家自然科学基金资助项目(81370896)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.007

510515 广州，南方医科大学附属武汉临床学院(梅稳，向光大，卢俊颜，李欢)；430070 武汉，广州

军区武汉总医院内分泌科(向光大，向林，董靖)

向光大，Email: Guangda64@hotmail.com

FundprogramNational Natural Science Foundation of China (81370896)

2016-08-22)