NF-κB通路对牙龈间充质干细胞分泌炎性因子能力影响的研究

张洋，刘杰，石海刚，李晓光，张维，刘娜，徐璐璐

·论著·

NF-κB通路对牙龈间充质干细胞分泌炎性因子能力影响的研究

张洋，刘杰，石海刚，李晓光，张维，刘娜，徐璐璐

目的探讨炎症作用下NF-κB通路对人牙龈间充质干细胞（GMSCs）分泌炎性因子能力的影响。方法体外分离纯化培养正常组织来源的GMSCs。在相同培养条件下，GMSCs被分成3组。应用梯度浓度TNF-α（0、10、20 ng/ml）诱导12 h。Annexin V-FITC/PI双染检测3组间GMSCs凋亡率差异。应用Western blot检测NLK、I-κBα、P-IκBα在NF-κB激活通路中的表达，Real-Time PCR检测TNF-α、IL-1β在GMSCs加入抑制剂BAY 11-7082后基因表达变化。结果凋亡检测显示，GMSCs凋亡率与TNF-α浓度呈正相关（P＜0.05）；Western blot结果显示，与对照组相比，NLK、I-κBα表达随TNF-α浓度增加而降低（P＜0.05），而P-IκBα表达量呈显著增高趋势（P＜0.01）。PCR检测结果显示，随外源性TNF-α浓度升高，10 ng/ml组与20 ng/ml组GMSCs的TNF-α与IL-1β基因表达量也显著升高（P＜0.01）。TNF-α诱导组加入NF-κB抑制剂BAY 11-7082后检测GMSCs，10 ng/ml组与20 ng/ml组IL-1β与TNF-α基因表达量下降，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论GMSCs中NLK在炎性环境下表达量降低，炎性因子可以通过NF-κB通路增强牙龈间充质干细胞中TNF-α和IL-1β的表达。

肿瘤坏死因子-α；牙龈间充质干细胞；炎症；核转录因子-κB

牙龈炎是口腔最常见的疾病，常常表现为牙龈出血、红肿。而在牙龈炎症反应中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与牙周组织疾病密切相关［1］，是牙龈炎症与免疫反应中重要的细胞因子［2-3］。TNF-α可以激活NF-κB信号通路，前期研究已经证实使用脂多糖（LPS）体外刺激牙周膜细胞可以分泌产生炎性因子［4］，但通过调控NF-κB通路能否抑制牙龈间充质干细胞（GMSCs）TNF-α和IL-1β的分泌，进而改善牙龈炎症状态尚无研究。NLK是NF-κB负向调节因子，与NF-κB活性有密切关系。本研究主要通过研究GMSCs的NF-κB通路激活后分泌炎性因子TNF-α、IL-1β的表达，探讨炎症作用下NF-κB通路对牙龈间充质干细胞分泌炎性因子能力影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例收集样本均来源于2014～2015年解放军总医院就诊患者，正常牙龈组织GMSCs来源于20～25岁拔除阻生齿需切除的无炎症龈瓣。本课题选取的所有患者均排除家族遗传病史、慢性感染性疾病史、全身系统性疾病、特殊药物服用史及吸烟史，本研究经本院伦理委员会批准，每位患者均签署了知情同意书。

1.1.2 主要材料与仪器L-DMEM培养基（美国Gibico公司），胎牛血清（美国Gibico公司），PBS（美国Gibico公司），GAPDH引物（深圳华大基因公司），Anti-β-actin、羊抗兔IgG（美国Abcam公司），PrimeScriptTM实时定量多聚酶链反应试剂盒、Premix Ex TaqTM试剂盒（日本Takara公司）；细胞培养瓶、培养板（美国Corning公司），CO2恒温培养箱（美国ThermoForma公司），超净工作台（北京长城空气净化设备工程公司），Centrifuge 5810R低温离心机（德国Eppendorf公司），流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司），Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR检测系统（美国Bio-Rad公司），全自动生化分析仪（日本Hitachi公司）。

1.2 方法

1.2.1 GMSCs分离培养纯化选取拔除第三磨牙、经患者同意剪取的牙龈龈瓣进行GMSCs细胞的原代培养［4］。将剪下的牙龈组织用剪剪碎，0.5%胰酶消化，PBS液体反复冲洗3～4次，放置37℃、5%CO2培养箱中消化30 min，收集至离心管中，将组织接种于小皿中，置盖玻片，加10%胎牛血清的L-DMEM培养液，置于培养箱中培养，每3 d换液1次，倒置显微镜下观察，当细胞生长达80%汇合时可消化传代，低密度接种法进行纯化。

1.2.2 GMSCs凋亡检测用不同浓度的TNF-α（分别为0、10、20 ng/ml）处理P3代GMSCs，每组诱导培养12 h。调整细胞数为1×106/ml，1000 r/min离心5 min，弃上清液；PBS洗1次，1000 r/min离心5 min；室温下100 μl标记溶液吹悬细胞，避光孵育10～15 min；500～1000 r/min离心5 min，PBS洗1次；避光加入荧光（FITC/PI）溶液，4℃孵育20 min，并不时振动；流式细胞仪分析，激发光波长488 nm，分别用波长为515 nm和560 nm滤器检测FITC/PI荧光。

1.2.3 Real Time PCR检测采用PrimeScriptTMRT-PCRKit试剂盒合成cDNA，引物见表1，定量PCR采用Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，各组体系配置完成后，应用Bio-Rad IQ5荧光检测仪进行检测。反应条件：95℃预变性10 s，1个循环，95℃变性5 s和60℃退火和延伸20 s，40个循环。mRNA的表达采用相对表达量进行比较，即目的基因相对于管家基因GAPDH的表达量所增加的倍数进行比较，采用2-ΔCt法计算各mRNA的相对表达量。

1.2.4 TNF-α与IL-1β mRNA水平将P3代GMSCs分成3组，应用不同浓度NF-κB抑制剂BAY 11-7082［5］诱导培养12 h后，分别提取3组RNA，Real-Time PCR检测TNF-α与IL-1β mRNA水平。其中对照组不加BAY 11-7082，另外两组的BAY 11-7082浓度为2 μM。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件对数据进行处理，计量资料以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.13 组GMSCs细胞形态学观察加入TNF-α后，细胞形态随TNF-α浓度的增加而发生变化，虽然细胞均为长梭形，且呈螺旋形克隆生长，但对照组细胞的通透性和折光性较好，细胞外基质分泌物较少，细胞状态优于加入炎性因子的两组。

2.2 凋亡检测结果如图1所示，对照组凋亡率为4.83%，10 ng/ml组为12.47%，而20 ng/ml组则达到20.16%。可见随TNF-α浓度的升高，GMSCs细胞凋亡率增加（P＜0.05）。

2.3 Western blot检测结果在TNF-α诱导下，与对照组相比，随TNF-α浓度增加，GMSCs的NLK和I-κBα mRNA表达降低（P＜0.05），而P-IκBα mRNA表达量增高（P＜0.05）。见图2、表2。

2.4 Real-Time PCR检测结果（1）与对照组相比，随外源性TNF-α浓度升高，GMSCs的TNF-α与IL-1β mRNA表达量显著升高（P＜0.01，表3）。（2）TNF-α（10、20 ng/ml）诱导组加入BAY 11-7082后诱导培养12 h，GMSCs的IL-1β与TNF-α mRNA表达量下降，但与对照组无统计学差异（P＞0.05，表4）。

表1 扩增片断所用引物序列

图1 GMSCs Annexin V-FITC/PI双染检测结果

图2 GMSCs的NLK与IκB-α和P-IκBα Western blot结果

表2 TNF-a诱导下3组GMSCs的NLK、I-κBa、P-IκBa的蛋白表达结果（n=3）

表3 在炎性因子TNF-α刺激下3组GMSCs的TNF-α与IL-1β基因表达（n=3）

表4 TNF-α诱导组加入BAY 11-7082后GMSCs 的IL-1β与TNF-α mRNA 表达（n=3）

3 讨论

GMSCs由Zhang等［6］首次从牙龈中分离，并鉴定其具有干细胞特性，经体内和体外实验显示出较强的自我更新、调节免疫和多方向分化能力。本实验从临床上采集拔牙切除的正常龈瓣组织，体外培养纯化得到GMSCs。最近有研究报道，炎性牙周组织中的间充质干细胞可分泌IL-6、IL-17等细胞炎性因子，可能与牙周炎症及牙周组织破坏相关［7］。TNF-α可诱导牙髓干细胞的NF-κB信号通路，导致牙髓细胞发生凋亡［8］。NF-κB通路与细胞凋亡有关，本实验凋亡检测证实，GMSCs在炎症因子刺激下凋亡比率也大大增加，可以推断NF-κB通路已经被激活。一般情况下，NF-κB与抑制分子蛋白I-κBα结合，以失活状态存在于细胞质中。在一系列的刺激下，IKK蛋白将I-κBα的两个关键丝氨酸磷酸化，I-κBα随即泛素化并被降解。释放游离的NF-kB进入细胞核内，激活一系列涉及多项生理、病理反应的下游靶基因。NLK是NF-κB信号传导的负向调节因子，它对于维持细胞的稳定和活性是必须的。NLK可以与IKK复合物相互作用，竞争结合TAK1，从而抑制TNF-a诱导的NF-κB活化过程［9-10］。经Western blot实验显示，NLK在炎性因子浓度升高时，表达量下降，进而有可能促进了NF-κB的活化，使炎性因子TNF-α与IL-1β表达含量显著升高。BAY 11-7082是不可逆性I-κBα磷酸化抑制剂，可以增加I-κBα的稳定性的，从而特异性阻断NF-κB信号通路［11］。为进一步证实GMSCs分泌TNF-α、IL-1β与NF-κB信号通路有关，应用抑制剂BAY 11-7082抑制NF-κB活性。Real-Time PCR结果显示，TNF-α与IL-β基因表达量下降，与对照组无明显差异（P＞0.05）。由于GMSCs在炎性因子刺激下可以激活NF-κB信号通路，增加TNF-α与IL-1β的表达。因此，调节和控制NF-κB信号通路对控制牙龈炎症有重要意义，选择特异性的NF-κB通路的抑制剂，可以为临床治疗提供新的途径。

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Effects of NF-kappa B pathway on secretion ability of inflammatory cytokines in gingival mesenchymal stem cells

Zhang Yang1，Liu Jie2，Shi Haigang3，Li Xiaoguang1，Zhang Wei3，Liu Na1，Xu Lulu11.Stomatological Center，General Hospital of PLA，Beijing，100853，China；2.Xiaoxitian Outpatient Department of Hospital 309 of PLA，Beijing，100091，China；3.Technical Institute of Physics and Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Beijing，100101，China

ObjectiveTo investigate the effects of NF-kappa B pathway on the secretion ability of inflammatory cytokines in human gingival mesenchymal stem cells（GMSCs）.MethodsGMSCs derived from normal tissues were isolated and purified in vitro. GMSCs were divided into three groups under the same culture conditions and induced by TNF-α（0，10 ng/ml，and 20 ng/ml）for 12 h. The difference of apoptosis rate between the three groups was detected by Annexin V-FITC/PI double staining.Western blot analysis was used to detect the expression of NLK，I-κBα，and P-IκBα in the activation pathway of NF-κB.The gene expression changes of TNF-α and IL-1β in GMSCs after adding the inhibitor of BAY-11-7082 were detected by Real-Time PCR.ResultsApoptosis detection showed that the apoptosis rate of GMSCs was positively correlated with the concentration of TNF-α.Western blot results showed that compared with the expression in the control group，the expression of NLK and I-κBα decreased along with the increase of TNF-α concentration（P＜0.05）.P-IκBα expression had the obvious tendency of increase（P＜0.01）.The PCR results indicated that along with the increase of exogenous concentration，the TNF-α and IL-1β gene expression significantly increased in 10 ng/ml group and 20 ng/ml group（P＜0.01）.After the adding of inhibitor BAY 11-7082，the expression of IL-1β and TNF-α decreased in 10 ng/ml group and 20 ng/ml group，but the differences between those groups and the control group were not significant（P＞0.05）. ConclusionNLK expression decreases in inflammatory environment.The inflammatory factors can enhance the expression of TNF-α and IL-1β in gingival mesenchymal stem cells through the NF-κB pathway.

tumor necrosis factor-α；gingival mesenchymal stem cell；inflammation；nuclear factor-kappa B

R 781.41

A

1004-0188（2016）05-0465-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.05.001

2016-01-27）

国家自然科学基金（31200741，51473175）；北京科技新星计划（Z14111000180000）；解放军总医院临床科研扶持基金（2013FC-TSYS-2007）

100853北京，解放军总医院口腔医学中心（张洋，李晓光，刘娜，徐璐璐）；解放军309医院小西天门诊部（刘杰）；中国科学院理化技术研究所（石海刚，张维）

前两位作者（张洋，刘杰）对本文有同等贡献，均为第一作者

徐璐璐E-mail：xululu1977@126.com