快速溶剂萃取-HPLC法测定骨碎补中柚皮苷的含量

黄北雄，戴柏桉（广西梧州食品药品检验所，广西梧州　543002）

快速溶剂萃取-HPLC法测定骨碎补中柚皮苷的含量

黄北雄＊，戴柏桉（广西梧州食品药品检验所，广西梧州543002）

目的：为骨碎补中柚皮苷的提取及测定开辟新的途径。方法：采用ASE350型快速溶剂萃取系统提取骨碎补中的柚皮苷；以高效液相色谱法测定骨碎补中柚皮苷的含量。色谱柱为Kinetex XB-C18，流动相为甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V），流速为0.8 ml/min，检测波长为283 nm，柱温为40℃，进样量为10µl。结果：柚皮苷的进样量线性范围为0.073 0～0.730 0µg（r=0.999 9））；定量限为0.73 μg，检测限为0.022 μg；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；加样回收率为98.92%～100.85%（RSD=0.72%，n=6）。结论：该方法简便、准确、专属性强，可用于测定骨碎补中柚皮苷的含量。

高效液相色谱法；骨碎补；柚皮苷；快速溶剂萃取

骨碎补为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J. Sm.的干燥根茎，气微、味淡、微涩，有疗伤止痛、补肾强骨、外用消风祛斑的功效，可用于跌扑闪挫、筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨痿软、耳鸣耳聋、牙齿松动、外治斑秃、白癜风等的治疗［1］。现代药理研究也表明骨碎补具有降血脂、降低胺基糖苷类抗生素的毒性和促进骨吸收等作用［2］。柚皮苷是骨碎补的主要有效成分之一，2015年版《中国药典》（一部）以柚皮苷作为其质量评价的指标。目前，骨碎补中柚皮苷的提取主要有煎煮法、加热回流法、索氏提取法［3-4］、超声萃取法、微波辅助萃取法［5-8］，测定方法有高效液相色谱法（HPLC）［9-11］和薄层-紫外分光光度法［12-13］，但是上述方法提取时间长、测定步骤烦琐。因此，笔者利用美国Dionex公司的快速溶剂萃取系统对样品进行提取，缩短提取时间、提高效率，并采用HPLC法测定骨碎补中柚皮苷的含量，以期为骨碎补中柚皮苷的提取及测定开辟新的途径。

1　材料

1.1仪器

ASE350型快速溶剂萃取仪（美国Dionex公司）；Ultimate 3000 DGLC型HPLC仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；XA205DU型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2试剂

柚皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：200001，纯度：94.7%）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3药材

骨碎补（玉林市康华中药饮片有限公司，批号：131206；广西玉林市祥生中药饮片有限责任公司，批号：140601；玉林市华济中药饮片有限公司；批号：14070301）经广西梧州食品药品检验所叶小强药师鉴定为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根茎。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Kinetex XB-C18（100 mm×4.6 mm，2.6 mm）；流动相：甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）；流速：0.8 ml/min；检测波长：283 nm；柱温：40℃；进样量：10µl。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液精密称取柚皮苷对照品适量，置于25 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含柚皮苷36.5 μg的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液取样品粗粉0.1 g，按1∶1的比例加入硅藻土后混匀，装于10 ml萃取池中，再用硅藻土填满萃取池，在ASE350型快速溶剂萃取仪控制面板编程进行萃取试验（萃取压力为1 700 psi，溶剂为甲醇，萃取温度为120℃，循环次数为2次，萃取时间为5 min，冲洗体积为100%）。萃取结束后，将萃取液转移至50 ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3系统适用性试验

精密量取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以柚皮苷峰计为5 000；保留时间为5.73 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1　高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；1.柚皮苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；1.naringin

2.4快速萃取条件的确定

2.4.1静态萃取温度平行取样品粗粉适量，共5份，按1∶1的比例加入硅藻土后混匀，装于10 ml萃取池中，用硅藻土填满萃取池，参考2015年版《中国药典》（一部）“骨碎补含量测定项下”水浴的温度，分别设定提取温度为80、100、120、140、160℃进行提取，再按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算柚皮苷的含量。结果，120℃时柚皮苷的提取量最高，超过120℃以后柚皮苷的提取量呈递减趋势，同时色谱图中未知杂质成分增多。因此，本试验选择120℃为提取温度。

2.4.2循环次数平行取样品粗粉适量，共3份，按1∶1的比例加入硅藻土后混匀，装于10 ml萃取池中，用硅藻土填满萃取池，分别设定循环次数为1、2、3次进行提取，再按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算柚皮苷的含量。结果，循环次数为2次和3次时柚皮苷的提取量最高。为节约提取时间，故本试验的循环次数选择2次。

2.4.3静态萃取时间平行取样品粗粉适量，共4份，按1∶1的比例加入硅藻土后混匀，装于10 ml萃取池中，用硅藻土填满萃取池，分别设定静态萃取时间为3、5、7、9 min进行提取，再按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算柚皮苷的含量。结果，提取时间为5、7、9 min时，柚皮苷的含量最高。为节约试验时间，故本试验选择静态萃取时间为5 min。

2.4.4冲洗体积平行取样品粗粉适量，共6份，按1∶1的比例加入硅藻土后混匀，装于10 ml萃取池中，用硅藻土填满萃取池，分别设定冲洗体积为0、40%、80%、100%、120%、150%进行提取，再按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算柚皮苷的含量。结果，冲洗体积为100%、120%、150%时柚皮苷的含量最高。为节约试验成本，故本试验冲洗体积选择为100%。

2.5线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0、2、5、10、15、20 µl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，µg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得柚皮苷的回归方程为y=1 888.8x+8.980 5（r=0.999 9）。结果表明，柚皮苷的进样量线性范围为0.073 0～0.730 0µg。

2.6定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得柚皮苷的定量限为0.73 μg；当信噪比为3∶1时，得柚皮苷的检测限为0.022 μg。

2.7精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，柚皮苷峰面积的RSD=0.04%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.8稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，柚皮苷峰面积的RSD=0.99%（n=7），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。

2.9重复性试验

取样品（批号：131206）粗粉适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，柚皮苷峰面积的RSD=1.47%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.10加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：131206）粗粉适量，共6份，每份0.05 g，精密称定，分别精密加入一定质量的柚皮苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果详见表1。

表1　加样回收率试验结果（n=6）Tab 1　Results of recovery test（n=6）

2.11样品含量测定

取3批样品粗粉适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算柚皮苷的含量，结果详见表2。

表2　样品含量测定结果（n=3）Tab 2　Results of content determination of samples（n=3）

3　讨论

本试验比较了甲醇-乙酸-水（35∶4∶65，V/V/V）、甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）两种不同比例的流动相，通过预试验表明，甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）为流动相时，柚皮苷峰与相邻色谱峰的分离效果较好、峰型较好。故本试验选择甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）为流动相。

综上所述，本方法简便、准确、专属性强，可用于测定骨碎补中柚皮苷的含量。

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［2］刘振丽，吕爱平，张秋海，等.骨碎补脂溶性成分研究［J］.中国中药杂志，1999，24（4）：222.

［3］张琳，杨中林.水提法与醇提法对骨碎补中总黄酮含量的影响比较［J］.江苏药学与临床研究，2004，12（3）：30.

［4］伍奕，蒋晓煌，蒋孟良，等.骨碎补中柚皮苷含量测定方法的优化研究［J］.湖南中医药大学学报，2010，30（3）：48.

［5］方婧，杨洪军，付梅红，等.微波协助提取在中药饮片含量测定中的应用（4）：微波法与药典法测定骨碎补中柚皮苷含量比较［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：75.

［6］高军，刘富春.正交试验优选枳实中柚皮苷的提取工艺［J］.中国药房，2014，25（35）：3 291.

［7］李园园，石磊，张振巍，等.混合均匀设计结合响应面法优选枳苓六妙口服液中药材的提取工艺［J］.中国药房，2013，24（39）：3 685.

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［9］张红旭，郭辉.HPLC法测定骨碎补酊中柚皮苷含量［J］.西北药学杂志，2006，21（2）63.

［10］岳春华，李顺祥.从骨碎补中制备新北美圣草苷和柚皮苷对照品的研究［J］.中草药，2008，39（4）：529.

［11］李遇伯，孟繁浩，潘晓峰，等.HPLC同时测定骨碎补药材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量［J］.药物分析杂志，2006（6）：808.

［12］吕勇均，邱宗荫.中药骨碎补提取物质量标准研究［J］.中国药业，2007，16（23）：26.

［13］陈洁.薄层-紫外分光光度法测定骨碎补中柚皮甙的含量［J］.中医正骨杂志，2007，19（3）：76.

（编辑：刘柳）

Determination of Naringin in Davallia mariesii byAccelerated Solvent Extration-HPLC

HUANG Beixiong，DAI Baian（Guangxi Wuzhou Institute for Food and Drug Control，Guangxi Wuzhou 543002，China）

OBJECTIVE：To develop a new way for the extration and determination of naringin in Davallia mariesii.METHODS：Naringin in D.mariesii was extracted by ASE350 accelerated solvent extraction system；HPLC was performed for the content determination of naringin in D.mariesii，the column was Kinetex XB-C18with mobile phase of methanol-5%acetic acid（25∶75，V/V）at a flow rate of 0.8 ml/min，detection wavelength was 283 nm，column temperature was 40℃，and injection volume was 10 µl.RESULTS：The linear range of naringin was 0.073 0-0.730 0µg（r=0.999 9）；the limit of quantitation was 0.73 μg，the limit of detection was 0.022 μg；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 98.92%-100.85%（RSD=0.72%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and specific，and can be used for the content determination of naringin in D.Mariesii.

HPLC；Davallia mariesii；Naringin；Accelerated solvent extraction

R917

A

1001-0408（2016）27-3875-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.44

＊副主任药师。研究方向：食品药品检验。电话：0774-3886969。E-mail：392271494@qq.com

（2015-12-19

2016-07-16）