在水稻上种出“人血清白蛋白”

文|杨代常 武汉大学 编辑|孙洁

在水稻上种出“人血清白蛋白”

文|杨代常 武汉大学 编辑|孙洁

项目成果：水稻胚乳细胞生物反应器及其应用

课题单位：武汉大学

目前全世界范围内血浆都十分紧缺，各国除了从血浆中提取人血清白蛋白之外，都试图采用生物技术生产、重组。武汉大学生命科学学院的杨代常教授改造了水稻种子从而制造大量的人血清白蛋白，占了种子的总可溶性蛋白的大约10%。

人血白蛋白具有多种临床应用价值，是我国的一线大宗临床用药，广泛地用于肝硬化腹水、烧伤烫伤、手术后体液的补充、失血过多导致的休克、脑水肿、癌症和艾滋病人放化疗的辅助治疗等。由于1克HSA可保留18 毫升的水，每5克的HSA保留循环内水分的能力约相当于100毫升血浆或200毫升全血的功能，在战场上可用于补充因失血导致的体液流失。此外，还被广泛地用于疫苗的赋形剂、蛋白药物的保护剂以及动物细胞和干细胞培养的添加剂。我国HSA每年需求量估计在420吨左右。随着国内外生物医药产业的蓬勃发展，HSA的市场需求将持续增加。

由于HSA在临床和生物技术中具有重要作用，存在巨大的市场需求，为摆脱血浆来源有限的产能限制，以及解决利用血浆来源的市售人血清白蛋白存在传染病毒如艾滋病病毒和肝炎病毒等的风险，各国科学家一直在努力寻找一种不依赖血浆、安全廉价的重组人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin，rHSA）的技术。自1987年开始，科学家们在细菌、酵母、动物细胞和植物等宿主中进行了大量的探索和尝试，并取得了一定的进展，但细菌、酵母、动物细胞各有缺陷，被证明不适于表达重组人血清白蛋白。

水稻胚乳细胞具有完整的真核细胞蛋白质加工体系，重组蛋白质的翻译、折叠和修饰都与哺乳细胞十分相近；而原核细菌以及酵母表达系统对蛋白的折叠和翻译后修饰都与人类有很大区别，产生的蛋白存在错误折叠和修饰的差异。OsrHSA经内膜系统进行加工和折叠成结构正确的有活性的蛋白质，并储藏在水稻种子的蛋白体内。

水稻种子繁殖系数高达1000倍以上，获得大量的蛋白质只需扩大水稻种植面积，而且容易储藏。而基于细胞培养和发酵的表达体系在扩大生产时，需要进行购置细胞生物反应器或者发酵罐及其相应设施，技术要求十分苛刻，不仅需要很大的固定资产投资，而且周期长。利用基因工程动物生产重组蛋白，实现规模化生产受限于非常长的动物繁殖周期。该发明技术只需在2年内可实现公斤级的重组蛋白质产品。

重组蛋白质在水稻种子可保存4年，蛋白质活性不会丧失，具有极强的稳定生产能力，保障稳定的产品供应。由于水稻种子的储藏蛋白不仅种类少，而且生化性质非常清楚。尤其是水稻基因组数据详实，为设计分离纯化工艺提供了良好的技术支撑，因而加工、提取和纯化工艺较为简单，从水稻米粉中提取OsrHSA只需3步柱层析即可达到企业质量标准，单批次生产周期仅需2.5天。

水稻是我国的主食，已有几千年的食用历史，其生物学背景清楚，目前没有任何有关动物病原菌和病毒侵入植物细胞和植物病毒与人共患的报道，因而利用水稻表达重组蛋白质，完全杜绝动物或人类病原菌或病毒的污染，具有更好的安全性。较传统的微生物如细菌或酵母发酵技术、哺乳动物细胞培养以及基因工程动物都可能存在内毒素、病原细菌、动物病毒等污染可能存在人畜共患的病原而引发传染疾病的风险；尤其是酵母或细菌的细胞壁具有复杂的糖结构，人对这类反应较为敏感。水稻没有人源性传染性疾病的病菌和病毒，还可避免血源性疾病。

水稻胚乳细胞生物反应器将通过发酵来合成蛋白质改为通过植物利用光合作用来完成，省去了在发酵过程中消耗大量能源和大量的污水排放问题，因而具有绿色环保特点。比较该技术与酵母发酵技术生产一克重组HSA的能耗估算：1克重组HSA的水稻原料生产过程的能耗是酵母的1/28。

水稻胚乳成为“蛋白生产车间”

水稻胚乳生物反应器技术是利用基因工程技术改造水稻，以水稻胚乳作为“蛋白生产车间”来表达和生产重组蛋白质或者多肽的技术。整个生产过程包含了基因克隆、蛋白表达，原料种植、收获、运输、储藏，蛋白提取、纯化、加工等技术（图1）。水稻胚乳生物反应器以农业的形式完成原料生产，而加工过程和最终产品又以医药的形式完成，将农业和制药业有机整合，因此又叫分子医药（Molecular Pharming），其产品称为植物源重组药物。

课题组利用水稻胚乳特异性启动子、水稻偏爱密码子优化、蛋白质定向存储技术，根据人血清白蛋白氨基酸序列，人工合成水稻偏爱密码子的人血清白蛋白基因全序列，将它克隆到水稻胚乳特异性的谷蛋白基因Gt13a的启动子和信号肽之后，构建了水稻转化载体pOsPMP114，然后转化成水稻植株，通过Western-blotting检测筛选出在水稻胚乳高效表达OsrHSA的基因工程纯合品系4-114-7。表达产物经Western-blotting、质谱分析及氨基酸N端序列、C端序列和全序列测序、等电点、圆二色谱和近紫外光谱等进行了结构确证，进一步说明OsrHSA具有与人血清白蛋白相同的一级和三级结构；通过X射线-晶体衍射证明了OsrHSA具有与HSA（2I2Z）相同的高级结构和构象。

按照我国中药材原料生产规范，建立了GAP管理规范，按照GAP规范和农业部的《农业转基因生物安全管理条例》建立了标准的规模化种植4-114-7-9-9-37-23水稻的生产和稻谷加工基地，可以提供优质的原料。

OsrHSA的纯化工艺经一系列中试优化，最后确定了整个纯化工艺流程，即首先高温提取、低pH沉淀、压滤澄清后，经过三步层析（阳离子、阴离子和疏水层析），产品纯度可达96.0%以上，宿主蛋白含量不高于5微克/克白蛋白，内毒素、热源等指标检测合格。整个纯化方法简便，得率高，每升提取液可获得350毫克以上纯品。经过连续4批中试生产，证实了该工艺稳定可行，能够进行产业化放大。

“双规”准则下的团队管理

图1 植物源重组人血清白蛋白技术流程

禾元生物的研发团队由具有分子细胞生物学、药理学、生物化学、临床医学等多种专业背景的技术人才组成。本科以上学历占公司总人数的95%以上，其中硕士/博士学历占公司总人数的30%以上。技术人员理论基础扎实，具有蛋白质和多肽表达及纯化工艺研究等生物医药项目研发的丰富经验。禾元技术团队稳定，坚持创新，对应用需求、技术现状和未来发展都有很深的理解，并拥有项目实施经验。开始这个项目之前，武汉大学生命科学学院杨代常教授组织了调研团队，对国内白蛋白的市场需求和产业发展作了详细的调查。他发现，我国白蛋白需求量达到210吨/年，都是靠血浆提取。但血浆短缺度达到2/3，50%靠进口。得出结论后，研发团队开始了夜以继日的研究实验。

研究所里定下“双规”准则：所有人必须“在规定时间内完成规定任务”。2011年，这一项目获得阶段性成功，杨代常和研发团队一起，迅速开展新工艺白蛋白产品的临床前药学、毒理、药物代谢动力学和药效评价工作。“如果一个技术开发者没有一个控制能力的话，难以做起来。做好这个工作不容易，公司的发展和项目的推进，得益于3个‘No’—no holiday，no weekend，no day and night(没有节假日、没有周末、没日没夜)。” 杨代常和他的研发团队成员一天一次讨论实验结果，周末晚上连续加班，仅用了两个月就把新药创制的纯度从小数点后面的3个9提高到6个9，达到99.999999%的纯度，是生物技术应用领域的一个飞跃。”

成果转化与应用

科研团队采取以市场为导向、以研发为驱动、以质量为保障的商业策略，充分发挥水稻胚乳细胞特异性表达技术平台的各项优势，研发具有较大市场前景、符合技术平台优势的各种医药产品、工业试剂和相关技术。采取产品及技术销售与服务并举的商业模式，短期内以产品原辅料与试剂为主、长期以生物医药制剂为主。采取国际与国内市场并重的营销策略，构建“研发驱动型”的高科技企业，形成集“研发、生产、销售”为一体的国际知名、国内首创的植物源生物技术企业。

药用。人血清白蛋白（HSA）是我国的一线大宗临床用药，被国家列为具有重大战略需求、重大市场需求和存在重大安全隐患的生物药“三重”品种。我们利用DNA重组技术，以水稻胚乳细胞作为生物反应器生产植物源重组人血清白蛋白（Recombinant Human Serum Albumin from Oryza sativa，OsrHSA)，克服了酵母体系表达重组人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin，rHSA）因结构不均一性和复杂糖结构引起的热稳定性差与免疫反应等问题，具有表达量高、成本低、安全性好、规模化容易、绿色环保等优势。经与市售人血清白蛋白“头对头”比较，在一级、二级和高级结构上与市售人血清白蛋白等同；经逐级放大，研发了简单而稳定的提取与纯化工艺，批间稳定一致；研究并制定了符合《中国药典》2015版要求的质量标准，除宿主蛋白、残留核酸含量和糖蛋白含量是自行标准外，其余标准均满足或高于《中国药典》2015版三部的人血白蛋白标准；建立了完善而规范的质量保障体系；药理、毒理和药代动力学与市售人血清白蛋白一致；大鼠肝硬化腹水药效试验与家兔失血性休克药效试验结果与市售人血清白蛋白等同。

工业用。本项目的产品已进入培养基添加剂、美容市场，产品销往美国、加拿大、欧盟、韩国、日本等国家，累计实现销售312万元，出口占60%。农民种植医用转基因水稻每亩增收980元，每年增加农民收入29.4万元，累计增加农民收入88.2万元；2013-2015年预计获得100吨左右的人血清白蛋白稻谷原料，可生产人血清白蛋白390～450公斤，含有人血清白蛋白的稻谷产值1006万元。

人血清白蛋白技术具有完全自主知识产权，国内首创、国际领先，标志着我国植物生物反应器的研究与应用走在世界前列，将对我国医药乃至国际上医药生产带来革命性影响，生产的OsrHSA可以解决我国人血清白蛋白供应紧张的局面，满足国家重大战略需求。