肺癌伴恶性胸腔积液中EGFR突变检测及其临床意义

田野，王园，刘思洋，姜文军，田大力

（中国医科大学附属第四医院胸心外科，沈阳 110032）

·论著·

肺癌伴恶性胸腔积液中EGFR突变检测及其临床意义

田野，王园，刘思洋，姜文军，田大力

（中国医科大学附属第四医院胸心外科，沈阳 110032）

目的 探讨和分析EGFR基因突变与肺癌伴恶性胸腔积液的生物学行为之间的关系，研究其临床意义。方法 通过检测30例Ⅳ期肺癌患者在伴有和不伴有恶性胸腔积液的情况下肿瘤组织内EGFR基因的突变情况，分析和探讨EGFR基因突变与恶性胸腔积液的生物学行为之间可能存在的关系。结果 肺癌伴恶性胸腔积液组EGFR的突变率高于肺癌不伴恶性胸腔积液组，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 肺癌伴恶性积液患者EGFR基因的突变率高于肺癌不伴恶性胸腔积液患者，EGFR突变与肺癌伴恶性胸腔积液患者的生物学行为之间存在相关性，靶向治疗可能作为此类患者的一种治疗选择，改善生存率及生活质量。

肺癌；恶性胸腔积液；EGFR突变

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，属于酪氨酸激酶型受体。EGFR在恶性肿瘤中常常过表达，与配体激活后其信号传导级联反应能产生多种效应，包括细胞增殖、分化、血管生成、转移以及抗凋亡作用［1］，因此在肿瘤的形成方面起到了非常重要的作用。近年来随着EGFR的深入研究，以EGFR为靶点的治疗为肺肿瘤患者提供了一个新途径，如特异性作用于EGFR激酶区的小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs），包括吉非替尼和厄洛替尼。但临床发现肺癌患者对TKIs类药物的反应性存在明显差异，其敏感性与EGFR基因的突变状态密切相关［2］，最常见的突变为19号外显子缺失突变和21号外显子点突变，占所有突变的85%～90%［3］。

恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）是肿瘤晚期最常见的并发症之一。统计结果表明，约有75%的MPE来源于肺癌、乳腺癌、卵巢癌及淋巴瘤，转移性肺腺癌为最常见的病理类型。伴发MPE的肺癌患者临床上已属于Ⅳ期，它可以引起进行性呼吸困难、咳嗽、胸痛等临床症状，对肺癌患者来说意味着较差的预后和较高的死亡率［4］。因此，有效控制MPE有着重要的临床意义。

目前针对MPE的治疗手段主要包括穿刺放液和腔内置管闭式引流、药物治疗、外科治疗，但效果有限。近年来靶向药物的兴起，为中晚期肺癌治疗提供了新的手段。研究表明，EGFR基因检测有突变的患者，在经过不间断服用基因靶向药物（TKIs类药物）后，绝大部分患者可以有效地控制MPE，明显提高生活质量，且随诊中发现可以很好的控制疾病进展，很少再次出现胸腔积液［5］。为了探讨肺癌并发MPE与EGFR基因突变之间的关系，本文首次提出检测Ⅳ期肺癌并发MPE患者的胸膜组织内EGFR基因突变情况，旨在找出EGFR基因突变情况与MPE的关系，从而进一步分析MPE的形成机制，同时也为MPE的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2013年1月至2014年7月于中国医科大学附属第四医院住院的Ⅳ期肺癌伴胸腔积液患者12例（MPE组），同时选择Ⅳ期肺癌不伴胸腔积液患者18例作为对照（非MPE组）；其中男性14例，女性16例，中位年龄63（42～84）岁，有吸烟史11例，无吸烟史19例，全部患者均病理证实为非小细胞肺癌，均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集：MPE组病例均经胸腔镜取胸膜转移癌组织，病理证实均为腺癌。非MPE组病例均经皮肺穿刺取癌组织，病理证实16例为腺癌，2例为非小细胞肺癌。所取标本均经10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，备用。

1.2.2 适时荧光定量PCR-HRM法检测基因突变：所得标本送至苏州科诺医学检验所通过实时荧光定量PCR-HRM法对EGFR基因外显子18、19、20、21检测。PCR-HRM检测原理：在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时监测荧光信号，荧光值随温度变化即溶解曲线；每一段DNA都有其独特序列，因而也有其独特的溶解曲线形状，与DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。

1.2.3 结果判断标准：将待测EGFR基因DNA提取物进行PCR扩增产物变性，所得溶解曲线与阴性样品对照，若二者曲线高度吻合，则判读为突变阴性（图1），若二者曲线不吻合，则判读为突变阳性（图2）。

图1 EGFR21外显子突变阴性熔解曲线图Fig.1 The negative melting curve of EGFR mutation in exon 21

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件包对所得实验数据进行统计学分析，应用χ2检验分析EGFR突变及与临床病理特征之间的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 EGFR在MPE组和非MPE组的突变情况

运用PCR-HRM法对MPE组及非MPE组活检组织进行EGFR基因检测。MPE组12例，共检测到8例（66.67%）发生EGFR基因突变，其中5例（41.67%）为19外显子突变，3例（25.00%）为21外显子突变，1例（8.33%）为19和21同时突变。非MPE组18例，共检测到4例（22.22%）发生EGFR基因突变，其中2例（11.11%）为19外显子突变，2例（11.11%）为21外显子突变。MPE组EGFR基因突变率高于非MPE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 EGFR21外显子突变阳性熔解曲线图Fig.2 The positive melting curve of EGFR mutation in exon 21

2.2 EGFR突变情况与临床特征之间的关系

比较EGFR突变情况与临床特征的关系，发现男性患者中有4例检测到EGFR突变，女性患者中有8例，女性患者突变率高于男性患者；吸烟患者中有3例检测到突变，非吸烟患者中有9例。EGFR突变与性别、年龄及是否吸烟无明显相关，见表1。

表1 EGFR基因的突变与临床特征之间的关系Tab.1 Relationship between EGFR gene mutations and clinical characteristics

3 讨论

EGFR是一个位于染色体7q12、分子量为170 000的跨膜蛋白，含有1个细胞外配体结合结构域、1个跨膜结构域和1个细胞内酪氨酸激酶结构域。当它和特异性配体结合后，细胞内结构域中特定的酪氨酸残基便发生自动磷酸化，引发细胞内信号级联反应，产生一系列效应，包括细胞增殖、分化、血管生成、转移及抗凋亡作用。小分子TKIs能够与ATP竞争性结合细胞内结构域中的结合位点，抑制EGFR的磷酸化和下游信号的传导。作用于EGFR激酶区的小分子TKIs，包括吉非替尼和厄洛替尼，是目前非小细胞肺癌患者最有效的靶向药，已被推荐为中晚期患者的一线药物，但并非对所有患者有效。对EGFR外显子发生突变的患者，作用于EGFR激酶区的小分子TKIs有效率可高达80%，而对野生型患者基本无效，因此EGFR突变是药物有效的前提。

MPE亦称肿瘤性胸腔积液，在引起胸腔积液的恶性肿瘤中，最常见的为肺癌、乳腺癌、淋巴癌，其中以肺癌居多。MPE产生的机制复杂多样，归纳起来有以下几个方面：恶性肿瘤侵袭脏层和壁层胸膜或伴随的炎症使毛细血管通透性增加，液体渗入胸膜腔；转移至壁层或脏层的肿瘤细胞阻塞壁层、脏层胸膜血管及淋巴管，使正常的胸液循环被打破；肿瘤转移至纵膈淋巴结引起胸腔积液的吸收减少等［6］。文献报道血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在MPE中高表达，推测VEGF参与了肺癌MPE的形成［7］，VEGF可通过增加血管通透性促进胸液形成［8］。而EGFR作为VEGF信号转导的受体，主要作用是介导VEGF的血管内皮细胞增生、趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能。正因为EGFR的上述作用，也就使得以EGFR为靶点的治疗为肺肿瘤患者提供了一个新途径，同时也为肺癌伴MPE患者的治疗提供了新的选择。然而，作用于EGFR激酶区的小分子TKIs类药物对MPE治疗效果却与EGFR基因的突变密切相关。因此，肺癌伴MPE患者EGFR基因的突变情况成为笔者关心的重点。

以往的文献报道大多是针对胸水细胞或者肺癌原发灶进行EGFR基因检测，而临床上肺癌MPE大多见于发生胸膜转移的患者。因此，本研究首次提出检测胸膜转移癌组织的基因突变，同时与未发生胸膜转移的癌组织来进行对比，很恰当的模拟了肺癌并发MPE的临床过程。本研究证明，肺癌伴MPE患者的胸膜组织EGFR突变率高于同期肺癌不伴MPE的患者，并发现发生突变的EGFR主要为19外显子和21外显子，12例突变病例中，7例为19外显子突变（23.33%），5例为21外显子突变（16.67%）。检测样本中女性、非吸烟的患者突变率较高［8］，与报道的总体结果吻合，但差异无统计学意义。研究结果同样也证实了EGFR的突变与性别、年龄、临床分期无关。

MPE是晚期肺癌最主要的并发症之一，尤其是转移性腺癌。据报道约15%的肺癌患者在被确诊时已有胸腔积液，50%的肺癌患者在病程中会出现胸腔积液，而MPE往往预示着较差的预后和较短的生存期。作用于EGFR激酶区的小分子TKIs类药物为MPE的治疗提供了一种新的途径，因此对肺癌伴MPE患者，可行EGFR基因检测，突变阳性者可服用TKIs类药物，抑制胸腔积液，延长生存期，而对于未行基因检测的患者也可实验性服用TKIs类药物［5］。

随着医学技术的发展和进步，肿瘤的治疗越来越强调个体化。对于肺癌的治疗除了手术、化疗、放疗等治疗手段外，以作用于EGFR激酶区的小分子TKIs为代表的靶向药物也已经成为肺癌治疗的一种新选择。靶向药物治疗因其具有高度选择性杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常细胞的特点，毒副作用相对较小，使肿瘤的治疗出现了新的曙光。同时，随着中国肺腺癌患者所占比例增长，这一人群正是作用于EGFR激酶区的小分子TKIs治疗的优势人群。因此，推广以基因测序为基础的EGFR突变状态检测，对指导临床合理用药、预测临床疗效和节约治疗成本都有很大的帮助。

［1］Ciardiello F，De Vita F，Orditura M，et al.The role of EGFR inhibitors in nonsmall cell lung cancer［J］.Curr Opin Oncol，2004，16（2）：130-135.

［2］Pao W，Miller V，Zakowski M，et al.EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from"never smokers"and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（36）：13306-13311.

［3］Gazdar AF.Activating and resistance mutations of EGFR in nonsmall-cell lung cancer：role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors［J］.Oncogene，2009，28（Suppl 1）：S24-S31.

［4］Bradshaw M，Mansfield A，Peikert T.The role of vascular endothelial growth factor in the pathogenesis，diagnosis and treatment of malignant pleural effusion［J］.Curr Oncol Rep，2013，15（3）：207-216.

［5］Goss GD，O’Callaghan C，Lorimer I，et al.Gefitinib versus placebo in completely resected non-small-cell cancer：results of the NCIC CTG BR19 study［J］.J Clin Oncol，2013，31（27）：3320-3326.

［6］Decamp MM，Mentzer SJ，Swanson SJ，et al.Malignant effusive disease of the pleura and pericardium［J］.Chest，1997，112（4 Suppl）：291S-295S.

［7］邹晖，熊盛道，徐永健.血管内皮生长因子在肺癌伴恶性胸腔积液中的检测及其意义［J］.中国肺癌杂志，2004，7（1）：70-72.

［8］Zebrowski BK，Yano S，Liu W，et al.Vascular endothelia1 growth factor levels and induction of permeability in malignant pleural effusions［J］.China Cancer Res，1999，5（11）：3364-3368.

［9］Shigematsu H，Lin L，Takahashi T，et al.Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers［J］.J Natl Cancer Inst，2005，97（5）：339-346.

（编辑 陈 姜）

Detection and ClinicalSignificance of EGFR Mutationsin Lung Cancer Patientswith MalignantPleuralEffusion

TIANYe，WANGYuan，LIUSi-yang，JIANGWen-jun，TIANDa-li

（DepartmentofThoracic Surgery，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

Objective To study the mutations of epidermal growth factor receptor（EGFR）gene in lung cancer patients with malignant pleural effusion，and explore its correlation with biological behavior.Methods By investigating mutations of EGFR gene in 30Ⅳstage lung cancer patients with or without malignant pleural effusion，the possible relationship between EGFR gene mutation and biological behavior of malignant pleural effusion was analyzed and discussed.Results EGFR mutation rate of lung cancer patients with malignant pleural effusion is higher than those without malignant pleural effusion（P＜0.05）.Conclusion Mutation rate of EGFR in lung cancer patients with malignant pleural effusion is significantly higherthan those patients withoutmalignantpleuraleffusion.Therefore，there isan association between mutations of EGFR and the biologicalbehavior of lung cancer.Targeted therapy could be used as a treatment option in patients with malignant pleural effusion，so as to improve the survival rate and quality oflife.

lung cancer；malignant pleural effusion；EGFR mutations

R743.2

A

0258-4646（2016）02-0150-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.012

沈阳市科学技术计划项目（F13-316-1-07）

田野（1981-），男，讲师，博士.

姜文军，E-mail：Cmu4hjwj@126.com

2015-06-28

网络出版时间：