TLR 4在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用△

林　苗　林　帆　洪富源　吴家斌（.福建医科大学省立临床医学院肾内科，福建省立医院福州35000；.福建医科大学省立临床医学院干部特诊二科，福建省立医院福州35000）

TLR 4在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用△

林苗1林帆2洪富源1吴家斌1（1.福建医科大学省立临床医学院肾内科，福建省立医院福州350001；2.福建医科大学省立临床医学院干部特诊二科，福建省立医院福州350001）

目的：探讨Toll样小体4（TLR4）在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用。方法：分别以TLR+/+和TLR4-/-小鼠为动物模型，检测尿蛋白/肌酐比值和血肌酐水平，透射电镜观察肾小球足细胞的形态，采用荧光实时定量PCR法测定足细胞相关标志物mRNA表达。结果：与TLR4+/+非糖尿病组相比，TLR4+/+糖尿病组小鼠尿白蛋白/尿肌酐比值明显升高，透射电镜可见足突融合现象，足突消失，足细胞相关标志物Podocin表达量明显下调；TLR4基因敲除的糖尿病小鼠较TLR4+/+糖尿病组尿白蛋白/尿肌酐比值显著下调，足细胞损伤减轻，Podocin表达量上调。结论：TLR4基因敲除可以降低糖尿病小鼠蛋白尿水平，减轻足细胞损害，这种足细胞保护作用与上调足细胞标志物Podocin的表达水平有关。

糖尿病 足细胞 动物模型 Toll样小体

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最主要的慢性并发症之一。DN发病率在慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的比例呈逐年上升趋势。近年来，炎症和免疫机制在DN的发生和发展中的重要作用已逐渐被认识。进一步了解炎症机制可能揭示复杂的代谢紊乱与DN结构和功能改变之间的关系。Toll样受体4（Toll-like receptor，TLR4）是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子。已知糖尿病肾小球足细胞的病变在蛋白尿发生中起重要作用，然而，TLR4是否在糖尿病肾病足细胞损伤中也发挥作用，还不十分清楚。本文以TLR4基因敲除小鼠模型，探讨TLR4在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：雄性12周龄TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠（杰克逊实验室，美国）16只，对照组（TLR4+/+）为相同周龄雄性C57BL/6小鼠16只（上海斯莱克实验动物有限责任公司SCXK（沪）2012-0002），随机分为TLR4-/-糖尿病组，TLR4-/-非糖尿病组，TLR4+/+糖尿病组，TLR4+/+非糖尿病组，每组各8只。实验小鼠自由饮水，普通饲料喂养，饲养温度20℃～25℃。

1.1.2试剂和仪器Trizol RNA抽提试剂、RNA逆转录酶，Olig dT，SYBRⓇPremix Ex TaqTM荧光实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，均按说明书操作。荧光定量实时PCR仪为Applied Biosystems 7300（美国Applied Biosystems公司）。透射电镜（菲利普CM120）由福建医科大学电镜室提供。

1.2方法

1.2.1糖尿病小鼠模型的建立：糖尿病组小鼠以链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美国Sigma公司）50mg/kg连续腹腔注射5d，在注射2周后血糖≥250mg/dl定义为糖尿病造模成功。每周称体重，每4周用血糖仪（Accu-Check，罗氏公司）测定血糖，尾静脉取血，并于代谢笼内收集小鼠尿液送检验科测定血肌酐，尿微量白蛋白及尿肌酐。于实验第24周，小鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉后处死小鼠，取肾皮质组织进一步实验。

1.2.2小鼠肾脏透射电镜观察：取新鲜肾脏上、下极皮质标本，切成1mm×1mm×1mm大小，用3％戊二醛固定后送电镜室制备标本及观察摄像。

1.2.3小鼠肾皮质RNA抽提及实时荧光定量PCR检测：将新鲜肾脏皮质标本用Trizol法抽提组织总RNA，经SuperScriptTMⅢRT试剂盒合成cDNA。由Takara公司合成。实时荧光定量PCR反应条件：Stage 1 95°C 10s，Stage 2 95°C 5s，60°C 31s，共40个循环，Stage 3 Dissociation。以βactin为内参，校正每个样本的Ct，以ΔCt代表每个基因的表达差异，确保每个模板的Ct值与起始拷贝数的对数存在线性关系。

2　结果

2.1STZ糖尿病小鼠模型鉴定STZ注射后第24周，与非糖尿病TLR4+/+和TLR4-/-小鼠病组相比，STZ糖尿病TLR4+/+和TLR4-/-小鼠体重均显著降低（分别为P<0.05，P<0.01），空腹血糖均显著升高（P<0.01）。说明本实验STZ诱导糖尿病小鼠造模成功。（表1）

表1　实验第24周各组实验小鼠的生理生化指标

2.2小鼠尿微量白蛋白和血肌酐测定：与TLR4+/+非糖尿病小鼠相比，TLR4+/+糖尿病小鼠肾脏体重比显著升高（P<0.01），尿白蛋白与尿肌酐比值（ACR）显著升高（P<0.01），血肌酐水平显著升高（P<0.01）。提示糖尿病肾病模型造模成功。与TLR4+/+糖尿病小鼠相比，TLR4-/-糖尿病小鼠肾脏体重比，尿白蛋白与尿肌酐比值，血肌酐水平均显著下调（P<0.05）。（表1）

2.3肾脏透射电镜观察：TLR4+/+糖尿病小鼠足细胞细胞膜破损，相邻足突之间出现融合现象，非糖尿病对照组足细胞细胞膜完整，未出现足突融合现象，而TLR4-/-糖尿病小鼠上述病变显著改善。（图1）

与非糖尿病小鼠相比，TLR4+/+糖尿病小鼠出现足细胞融合，足突消失，TLR4-/-糖尿病小鼠上述病变显著改善。GBM基底膜；Pd足细胞；Cap毛细血管。

2.4足细胞相关标志物mRNA表达情况：与对照组相比，TLR4+/+糖尿病小鼠Podocin，WT1（分别P<0.01，P<0.05）表达显著下调，而Nephrin水平有下调趋势，但未达统计学意义。与TLR4+/+糖尿病小鼠相比，TLR4-/-糖尿病小鼠podocin水平显著上调（P<0.05）。（图2）

与非糖尿病TLR4+/+对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；与TLR4+/+糖尿病小鼠相比，#：P<0.05。

3　讨论

糖尿病肾病特征性的肾小球病理改变包括系膜细胞的增生和肾小球基底膜的增厚，然而上述病理改变只能解释30％～50％的糖尿病蛋白尿发生和肾小球滤过率的改变。近年来，足细胞损伤在糖尿病肾病蛋白尿发生中病理机制逐渐被认识。足细胞是肾小球滤过屏障的组成部分，与其他肾小球细胞不同，足细胞的再生能力有限，因此在出现损伤后足细胞足突融合，足细胞附着能力减弱，肾小球基底膜裸露区域增多，蛋白质屏障被破坏，最终导致蛋白尿产生。因此研究足细胞损伤的机制可能为治疗糖尿病肾病蛋白尿提供新的依据。

TLR4是机体天然免疫的一个经典受体，它可特异性识别病原微生物继而激活核因子NFκB，最终促进炎症因子的释放。近年来，许多研究表明，内源性的配体例如高血糖，游离脂肪酸，脂蛋白，血管紧张素II也能激活TLR4/NFκB通路，促进炎症反应发生。因此，TLR4通路在非感染性炎症中也起重要作用。例如2型糖尿病患者血中单核巨噬TLR4表达升高，与患者糖基化血红蛋白水平和胰岛素抵抗密切相关。免疫组化研究已证实，TLR4在肾脏固有细胞例如肾小管上皮细胞，介导糖尿病肾小管间质病变和肾间质纤维化。此外TLR4也在系膜细胞和肾小球内皮细胞上广泛表达，参与糖尿病肾病系膜增生和免疫相关肾病的炎症反应。在冷球蛋白血症相关膜增生性肾小球肾炎动物模型中，免疫复合物沉积激活足细胞TLR4促进炎症介质释放在发病中发挥重要的作用。本研究中，我们采用STZ诱导糖尿病小鼠模型，在24周后，糖尿病组小鼠已出现ACR显著升高，与此一致，电镜下足细胞出现脱落、足突融合现象，提示糖尿病肾病早期足细胞形态已发生改变。而TLR4基因敲除的小鼠ACR和血肌酐水平较未敲除的TLR4+/+组均显著降低，提示TLR4可能促进糖尿病肾病蛋白尿产生，这种作用独立于血糖水平存在，各实验组血糖无明显差异。电镜下，TLR4基因敲除组足细胞脱落，足突融合明显减轻，提示TLR4基因敲除对足细胞有保护作用。

我们进一步检测了足细胞相关标志物Nephrin、Podocin、WT-1 mRNA的表达情况，结果研究显示糖尿病组上述足细胞标志物表达均下调与电镜下足细胞损伤结果一致。TLR4基因敲除上调了Podocin的表达而Nephrin和WT-1表达无明显差异，提示TLR4在足细胞损伤的作用可能是作用于Podocin从而导致足突融合，滤过屏障受损。国外Ishwarlal et al.在STZ诱导的糖尿病17周的TLR4敲除小鼠模型也发现Podocin在TLR4敲除的小鼠显著上调，与本实验一致，然而同时WT-1表达水平也上调，可能与该实验模型与我们的实验模型诱导的病程不同有关。TLR4基因敲除对足细胞的保护机制可能与足细胞的磷酸肌醇依赖的激酶1（PDK1）上调，从而激活PI3K/Akt信号传导途径，抑制足细胞的凋亡密切相关。此外，高血糖可能通过激活蛋白激酶C和细胞内活性氧自由基，进而激活TLR4相关途径促进足细胞炎症因子的释放，引起足细胞损伤。进一步通过足细胞培养体外实验，可揭示其中更多的机制。

总之，TLR4信号传导途径在糖尿病肾病的足细胞损伤、肾小球滤过屏障受损和蛋白尿形成中发挥重要的作用。进一步探索抑制TLR4通路的药物可能对治疗糖尿病肾病、延缓蛋白尿进展有重要的意义。

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R 587.2

B

1672-8351（2016）11-0124-02

△福建省自然科学基金（2014J05083）