可降解复合止血胶原蛋白海绵的制备及生物应用性能研究*

程玮璐，李 慧，贺金梅，李大龙，王晓峰，吴亚东，黄玉东**

（1.哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨150001；2.哈尔滨医科大学附属第二医院口腔颌面外科，黑龙江哈尔滨150001）

可降解复合止血胶原蛋白海绵的制备及生物应用性能研究*

程玮璐1，李 慧2，贺金梅1，李大龙1，王晓峰2，吴亚东1，黄玉东1**

（1.哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨150001；2.哈尔滨医科大学附属第二医院口腔颌面外科，黑龙江哈尔滨150001）

胶原蛋白（Col）是自然界中一种生物相容性优异的材料，可用于伤口愈合和组织修复。然而，由于其本身力学强度差，止血效果一般，纯胶原海绵不能广泛在齿科手术中用于止血填充材料。利用氧化再生纤维素（ORC）作为胶原蛋白海绵中的填料可提升材料强度及止血效果。结果表明：Col-0.25%ORC具有最优异的力学强度，并可有效地缩短止血时间。所有材料均可以在三周内完成体内降解，并且无明显异常反应。

胶原蛋白；氧化再生纤维素；止血；复合材料

前言

当今世界科技的发展日新月异，与此同时，医疗技术水平也在快速提高，手术治疗范围不断扩大，如何缩短手术时间，减少术中、术后出血都对加速患者伤愈有着重要的影响，尤其在各种突发事件及恶劣环境条件下，使创面在短时间内快速有效止血则是抢救生命最关键的环节。为了能够达到更加优异的止血效果，人们在原有止血材料、技术的基础之上，开始在新型止血材料的开发方面进行研究，并已经在临床应用中逐步得以发展。自20世纪70年代以来，随着医用天然高分子材料和医用合成高分子材料用于止血材料和外伤敷料的研究，迄今为止该类材料的开发、应用已经有了质的飞跃[1]。

目前的止血材料有纤维蛋白胶、明胶海绵、氧化再生纤维素、壳聚糖、海藻酸盐、微纤维胶原、凝血酶、壳聚糖、沸石、胶原蛋白海绵、各种合成的高分子医用胶等[2～4]。其中，胶原蛋白是自然界中一种生物相容性优异的材料，可用于伤口愈合和组织修复。然而，由于其本身力学强度差，止血效果一般，纯胶原海绵不能广泛在齿科手术中用于止血填充材料[5,6]。氧化再生纤维素以其更加优异的性能在众多止血材料中脱颖而出[7,8]。目前临床上使用最广泛的氧化再生纤维素类医用可吸收止血纱布是美国强生（Johnson）公司生产的可溶性止血纱布，在国内又称“速即纱”[9]。氧化再生纤维素与血液接触后可膨胀成为棕色的凝胶块，有助于形成凝血块从而达到止血目的；同时，氧化再生纤维素还有一定杀菌能力。

本文利用具有一定力学强度的氧化再生纤维素作为胶原蛋白海绵的填料，制备出了新型可降解胶原蛋白/氧化再生纤维素复合型止血海绵，并对其化学结构进行了表征，考察了其理化性能、止血效果及体内降解周期。

1 实验部分

1.1 Col/ORC复合止血海绵的制备

采用牛跟腱为原材料，利用酶解法在0.2%的醋酸溶液中提取胶原蛋白，4℃间歇搅拌3d，离心取上清液，盐析，透析6d后冻干备用。将冻干胶原溶于0.5%醋酸溶液中,胶原（干样品）与ORC（实验室自制）[10]按多种不同质量比复合：Col-0.25%ORC，Col-0.5%ORC，Col-1%ORC。ORC粉末分散在水中,经过超声震荡20min后与胶原分散液混合搅拌,低功率超声振荡使混合均匀,风干成复合材料。对照组采用市售TrauerR 胶原蛋白海绵（Control），以及自制纯胶原蛋白海绵（Col）。

1.2 复合止血海绵的理化性能表征

采用NIGOLET-Nexus670傅里叶变换红外光谱仪进行复合材料的红外光谱测定。采用WD-1型电子万能实验机（拉伸速度为10mm/min）进行拉伸实验，记录材料断裂时的拉力及拉伸断裂应变，计算材料的拉伸强度。采用JJC-1光学型接触角测定仪测量材料表面的接触角。

1.3 复合止血海绵的止血效果评价

将测试材料剪成2.0cm×2.0cm大小若干块，称重、灭菌、备用。选取体重3.0～3.5kg的新西兰兔分为若干组，每组5只。按40mg/kg剂量静脉缓慢注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉。

1.3.1 兔耳动脉止血模型

将其中央耳动脉区域备皮、消毒，沿耳动脉方向切开皮肤，钝性分离出耳动脉、静脉和神经，再用手术刀横向切断动脉，待血液涌出后立即用1层测试材料或对照样贴敷于伤口表面并使用推拉力计施加3N的压力，每隔10s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间，并取下材料称重，通过公式（1）计算出血量，取5组平均值为最终结果。

式中mBL—出血量；

m1—止血后材料质量；

m0—贴敷前材料质量。

1.3.2 兔耳动脉止血模型

动物麻醉后将其腹部朝上固定，腹部备皮尺寸约5cm×4cm，常规消毒后，于剑突下沿腹中线纵向切开皮肤，钝性分离皮下组织，暴露腹膜，纵向切开腹膜，切口长约5cm，用医用消毒纱布吸干切口部位的血液和组织液。充分暴露肝前叶，在其表面用手术刀作1.0cm×1.0cm的创口，深度约3mm，并将创面肝被膜及其下的肝组织取下。血液涌出后，立即将1层测试材料或对照样贴敷于创口表面并使用推拉力计施加3N的压力，每隔10s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间，并取下材料称重，通过公式（1）计算出血量，取5组平均值为最终结果。

1.4 复合止血海绵的体内降解评价

将测试材料裁剪成直径约为10mm的圆片，灭菌、备用。兔腹腔处缓慢注射戊巴比妥钠溶液麻醉，然后分别将测试材料（Col/ORC）和对照组（Col, Control）植入到兔背部皮下，每只动物背部均选取6个植入点，间隔2～3cm。随即注射20000U/kg庆大霉素。每种植入材料均选取7d、14d、28d三个植入期，每种材料每个植入期使用3只大鼠，所有实验动物集中饲养直至植入期结束。待每个植入期结束时，对相应的实验动物注射过量的戊巴比妥钠溶液进行人道处死，取出材料植入部位及其周围的组织，放入20%福尔马林溶液中固定。待乙醇梯度脱水处理后，进行石蜡包埋、切片、HE染色，最后进行组织病理学观察。

2 结果与讨论

2.1 Col/ORC复合海绵的理化性能分析

从红外谱图中（图1）我们可以看出3335cm-1处的峰是分子间氢键O-H伸缩振动。1724cm-1处的峰是ORC的酯键上C=O伸缩振动特征峰，1314cm-1处的峰可能是亚甲基的弯曲振动，也可能是酯的C-O伸缩振动，而1080cm-1峰在复合材料里可能是仲醇上C-O伸缩振动，在胶原蛋白里则可能是与氨基相连的碳的C-H伸缩振动峰。1031cm-1处的峰是伯醇的伸缩振动，也是ORC的特征峰。

Col/ORC复合材料的红外光谱图中，随着ORC含量的增加，1724cm-1以及1031cm-1处的峰越来越明显，Col-1%ORC该处的峰最尖最突出，而1080cm-1处的峰逐渐减弱，推测1080cm-1处的峰是在胶原蛋白里与氨基相连的碳的C-H伸缩振动峰的可能性更大。两处吸收振动峰的趋势性变化说明二者混合相互作用后，ORC的加入使胶原蛋白的官能团产生变化，发生了分子间的相互作用。

从拉伸试验结果看出（图2A）：Col力学性能最佳因其拉伸力最大，Col-0.25%ORC次之，复合材料最大拉伸力随OMC含量增加而减小，Control最小。在气、液、固三相交界处，自固-液界面经过液体内部到气-液界面的夹角称为接触角,用以表示材料能被润湿的性能。根据湿润角的大小判断润湿情况：θ=0°不存在铺展，0°<θ<90°浸湿，90°<θ<180°粘湿，θ=180°完全不润湿。理论上讲，较小的接触角，意味着材料表面湿润良好。从图2B中得出Col表面接触角最小,因此其湿润性最佳，Col-0.25%ORC的表面湿润性次之，复合材料接触角随ORC含量增加而增加，Control最大。

图1 不同材料的红外谱图Fig.1The FTIR spectra of control,Col,Col/ORC composites（Col-0.25%ORC,Col-0.5%ORC,Col-1%ORC）,and ORC

图2 Col与Col/ORC复合海绵物理性能对比：（A）拉伸强度；（B）接触角测定Fig.2The physical properties comparison between the Col and the Col/ORC composites:（A）Tensile strength;（B）Contact angle.

2.2 Col/ORC复合海绵的止血性能分析

与对照材料的止血时间相比（表1），不论是兔耳动脉止血模型还是兔肝部止血模型，Col及其与ORC的复合材料止血时间均明显减小，差异具有统计学差异p<0.05。止血时间最短的是Col-0.25% ORC，耳部止血时间为22.5±3.99s,肝部止血时间为23.17±1.33s,与所有的测试材料相比，止血最为迅速。耳动脉止血实验中，Col-0.5%ORC材料止血时间为30.5±8.29s，止血速度较快。肝部止血实验中，Col也可迅速止血，时间为26.17±3.76s。

与对照材料组的出血量相比，在兔耳动脉止血模型或兔肝部止血模型中，Col及Col/ORC复合材料组的出血量均明显减小，经计算统计学差异p< 0.05，实验结果具有统计学意义。其中，Col-0.25% ORC组的出血量最小，耳部模型出血量是为36.87±9.07mg,肝部模型出血量为52.4±16.12mg。

图3 两种创伤模型中Col及不同Col/ORC复合海绵的平均出血量Fig.3The amount of bleeding of Col and different Col/ORC composites in injury models

表1 两种创伤模型中Col及不同Col/ORC复合海绵的平均止血时间Table 1The mean hemostatic time of Col and different Col/ ORC composites in two kinds of rabbit injury models

2.3 Col/ORC复合海绵的体内降解性能分析

种植28d时，按原切口位置及大小再次切开皮肤组织暴露的植入区，可见三个切口内组织恢复良好，无化脓、渗出液、充血或炎性水肿等情况。分别将植入7，14及28d后的材料从组织中分离出来，并测量材料直径大小，图4结果显示，植入7d时，很容易从植入点观察到三种材料，形状近似团状，手术器械将其从组织中分离出来容易，（a）Control材料直径约为6mm，（b）Col材料与（c）Col-0.25% ORC材料直径约为4.5mm，（c）颜色为乳白色，（a）及（b）材料颜色较（c）浑浊暗红，疑似植入后组织内炎症反应过程中组织液渗出所致。植入14d时，肉眼观察植入点材料较困难，用器械寻找，发现材料与周围组织粘连，但仍可剥离，（d）Control材料及（e）Col材料形状为条状，半透明，（f）Col-0.25%ORC呈圆形，直径较7d时明显减小，约为1.0mm。植入28d时，肉眼未见材料样物质，用器械亦未探查到。

图5为各材料种植于兔腿部肌肉1,7,14,28d后的组织病理图。经HE染色的材料呈不规则团状或散在的碎片状，颜色为比正常组织深的深紫色或紫红色。由于切片及染色过程存在一定误差，所以有些材料并未着色，或呈不规则岛状空腔。

1d组可见：图5a中部分肌纤维坏死消失，中间可见不规则Control材料。图5b肌肉组织内不着色Col材料，图5c肌组织及其周围可见大量的炎症性细胞浸润.

7d组可见：图5d部分坏死的肌纤维被纤维性结缔组织取代，可见不规则Control材料和多核巨细胞,图5e肌组织内出血、大量的炎症性细胞浸润，成纤维细胞增生，图5f肌肉组织中有大量的多核巨细胞以及被其吞噬的材料Col-ORC碎片。

14d组可见：图5g～i中均可见炎症反应，图5g可见残存的材料碎片，同时仍有多核巨细胞。图5h和图5i中肌肉发生纤维组织增生，图5i中炎症性细胞浸润较图5h更为严重。

28d组可见：图5j～l中，肌肉组织内均未见材料碎片，图5k和图5l组织恢复良好，图5j内仍可见局部的炎症性反应.

图4 不同材料体内植入7，14d局部组织肉眼观察及28d植入部位肉眼观察Fig.4（A）The observation of subcutaneously implanted materials（control,Col and Col-0.25%ORC）stripped out after 7 and 14 days of implantation;（B）The healing of incision after 28 days implantation surgery;（C）The status of the tissues surrounding planting areas after 28 days implantation surgery

图5 不同材料分别植入兔腿部1，7，14和28d后的局部组织病理图（HE染色）Fig.5The histopathological examination of control,Col and Col-0.25%ORC materials after 1,7,14 and 28 days of implantation.

由此可见，三种材料埋入体内后随时间逐渐被降解，初期都会引起周围肌肉组织的炎症性反应甚至局部坏死，而后成纤维细胞增多，纤维组织增生，这些过程促进组织愈合，同时炎症逐渐减弱。28d时三种材料基本降解完全，Col及Col-ORC组肌肉组织恢复良好，Control组仍见局部炎症反应，说明需更长时间才能恢复正常。

3 结论

本文制备了一种以ORC短纤为填料的胶原蛋白复合止血材料。通过红外谱图可以看出，添加ORC之后，胶原蛋白复合材料中羧基特征峰明显。与对照组（TrauerR 胶原蛋白海绵）相比，本实验室研制出的Col-0.25%ORC复合材料具有更好的力学强度，润湿性更为优异。因此，该材料的止血效果大幅提升，并可以在植入体内28d后完全降解，对周围组织无明显异常影响。综上所述，此复合材料可以作为止血填充体广泛地用于口腔颌面外科手术中，具有广阔的应用前景。

［1］TIMOR L S,GOLDBART A D,SEGAL N,et al.Circulating cytokines in patients undergoing tonsillectomy with fibrin glue［J］.International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology,2012, 76:419～422.

［2］李若慧，常康威，王思.壳聚糖-羟丙基纤维素共混膜的生物黏附性［J］.化学与黏合,2012,35（4）:23～27.

［3］王勇.体内可吸收止血材料研究及临床应用［J］.生物医学工程学杂志,2009,26（4）:922～926.

［4］于美丽，杜智.可吸收止血材料的研究现状及临床应用［J］.北京生物医学工程,2008,27（2）:208～211.

［5］何薇婧，黄玉东，李艳辉.交联胶原蛋白的降解表征［J］.化学与黏合,2005,27（3）:139～142.

［6］段志广.类人胶原蛋白止血海绵的性能研究［D］.西北大学,2008.

［7］SCHER K S,COIL J A.Effects of oxidized cellulose and microfibrillar collagen on infection［J］.Surgery,1982,91:301～304.

［8］SCHONAUER C,TESSITORE E,MORACI A C,et al.The use of local agents:bone wax,gelatin,collagen,oxidized cellulose［J］.European Spine Journal,2004,13:（Supp1.1）:S89～S96.

［9］SPANGLER D,ROTHENBURGER S,NGUYEN K,et al.In vitro antimicrobial activity of oxidized regenerated cellulose against antibiotic-resistant microorganisms［J］.Surgical Infections,2003, 3（4）:255～262.

［10］CHENG W L,HE J M,HUANG Y D,et al.Preparation and characterizationofoxidizedregeneratedcellulosefilmfor hemostasis and the effect of blood on its surface［J］.Cellulose, 2013,20:2547～2558.

Preparation and Characterization of Collagen Composite Hemostatic Sponge and the Study on Its Biodegradation

CHENG Wei-lu1,LI Hui2,HE Jin-mei1,LI Da-long1,WANG Xiao-feng2,WU Ya-dong1and HUANG Yu-dong1
（1.College of Chemical Engineering and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150001,China;2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China）

The collagen is widely used in wound healing and organ repair which is a material with excellent biocompatibility.However,the limited strength and fair hemostatic effect of collagen restrains its application as hemostasis and filling materials in dental treatment.In this study,the ultra-porous collagen（Col）/oxidized regenerated cellulose（ORC）composites is prepared.The results of physical properties measurement indicated that the Col has the most excellent tensile strength,and the Col-0.25%ORC performed optimized wettability,porosity and water absorption.The Col-0.25%ORC has the most outstanding strength and can effectively shorten the hemostatic time,and it can be degraded completely without inflammatory reaction after 3 weeks.

Collagen;oxidized regenerated cellulose;hemostatic;composite

TQ342.87

A

1001-0017（2016）04-0231-05

2016-04-07*基金项目：威海市经济发展计划项目（编号：2013GNS028）；中国博士后科学基金项目（编号：2013M541372）

程玮璐(1987-)，女，吉林省吉林市人，博士在读，研究方向为生物医用高分子材料。

**通讯联系人：黄玉东(1965-)，男，博士，教授，主要从事复合材料相关研究。E-mail:ydhuang.hit1@aliyun.com