PM 2.5对支气管上皮细胞色素上皮衍生因子表达的影响①

朱成华，施丽君，张灵凤，计晓兰，杜强

PM 2.5对支气管上皮细胞色素上皮衍生因子表达的影响①

朱成华1，2，施丽君2，张灵凤2，计晓兰2，杜强1，2

目的探索不同浓度PM 2.5对支气管上皮细胞（BEAS-2B）色素上皮衍生因子（PEDF）蛋白表达的影响。方法BEAS-2B细胞传代培养，加入低、中、高浓度PM 2.5悬液（25μg/m l、50μg/m l、100μg/m l）刺激24 h。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中PEDF水平；Western blotting检测BEAS-2B细胞中PEDF蛋白表达水平。结果与对照组相比，PM 2.5浓度为25 μg/m l时，细胞内和上清液中PEDF蛋白水平均有增加趋势，但无统计学意义（t=-0.730，t=-1.840，P＞0.05）；PM 2.5浓度为50μg/m l 和100μg/m l时，细胞内和上清液中PEDF蛋白表达水平明显增高（t＞5.798，P＜0.01）。结论中、高浓度PM 2.5能够增加支气管上皮细胞中PEDF蛋白水平，并呈浓度依赖性。

细颗粒物；支气管上皮细胞；色素上皮衍生因子

［本文著录格式］朱成华，施丽君，张灵凤，等.PM 2.5对支气管上皮细胞色素上皮衍生因子表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（10）：1151-1153.

CITED AS：Zhu CH，Shi LJ，Zhang LF，etal.Effectsof PM 2.5 on expression of pigmentepithelium-derived factor in bronchialepithelial cells［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（10）：1151-1153.

近年来，细颗粒物（particulatematter，PM）2.5污染已成为我国许多大中城市空气污染的罪魁祸首，也是影响居民身心健康的重要因素［1］。PM 2.5暴露可以诱导气道炎症及氧化应激损伤［2］。色素上皮衍生因子（pigmentepithelium-derived factor，PEDF）是一种具有多功能的糖蛋白，最初从胎儿视网膜色素上皮细胞培养液分离，在慢性气道炎症性疾病的发生发展中具有重要的作用［3］。一方面PEDF具有抗炎和抗氧化等生物学特性［3］，同时亦通过促炎作用参与气道炎症的形成［4-5］。本实验旨在观察不同浓度PM 2.5干预对人支气管上皮细胞（bronchial epithelial cells，BEAS）PEDF蛋白表达水平的影响。

1　材料与方法

1.1试剂

PEDF抗体、GAPDH抗体：ABCAM公司，英国。BEAS-2B细胞：ATCC公司，美国。PEDF酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：EBIOSCIENCE公司，美国。总蛋白提取试剂盒：SIGMA公司，美国。

1.2方法

1.2.1PM 2.5的提取

参照我们前期发表的文献［6］，采用TH-150中流量总悬浮微粒采样器（武汉天虹）采样，采样点位于南京市鼓楼区，经超声洗脱处理后收集PM 2.5，灭菌后真空冷冻干燥，-20℃保存备用。

1.2.2BEAS-2B细胞的培养

BEAS-2B细胞接种于50m l培养瓶，使用1640培养液和10%胎牛血清培养细胞，每隔3天换液1次，当细胞融合后，用PBS液洗涤2次，加入适量0.25%胰酶消化，显微镜下观察，当细胞收缩成圆形后，弃去消化液，加入培养液，无菌吸管吹打数次至贴壁细胞全浮起，接种于六孔培养板内继续培养。初始细胞接种密度为（2～5）×105/m l。

1.2.3PM 2.5刺激

当细胞进入对数生长期、细胞融合达80%，吸弃培养基，以无血清培养基培养6 h后，分为四组。对照组不加PM 2.5悬液（PM 2.5用培养基溶解）；PM 2.5低、中、高浓度组分别加入PM 2.5悬液25μg/m l、50 μg/m l、100μg/m l。PM 2.5悬液刺激24 h后收集上清液和细胞用于检测。

1.2.4ELISA

采用ELISA法检测BEAS-2B细胞上清液中PEDF蛋白的表达。收集细胞上清标本，参照ELSIA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在490 nm处测吸光度光密度（OD）值，绘制标本曲线，检测标本浓度。

1.2.5Western blotting

使用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白（凯基生物工程有限公司，南京），二喹啉甲酸法测定浓度。按试剂盒说明书进行操作。BCA法测定蛋白浓度。Western blotting法检测PEDF蛋白表达水平。GAPDH作为内参，使用10%SDS-PAGE凝胶电泳，电转印将蛋白质转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭；加入1 ∶1000抗PEDF单克隆抗体4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记二抗常温孵育90m in。TBST洗涤，ECL发光显影，Bio-Rad Quantity One软件分析数据。

1.3统计学分析

2　结果

2.1ELISA

PM 2.5低浓度组PEDF蛋白有升高趋势，但与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；PM 2.5中、高浓度组PEDF蛋白水平明显增加（P＜0.01），且呈浓度依赖性。见表1。

表1　各组BEAS-2B细胞上清液PEDF蛋白水平（ng/m l）

2.2Western blotting

PM 2.5低浓度组PEDF蛋白有升高趋势，但与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；PM 2.5中、高浓度组PEDF蛋白水平显著增加（P＜0.001），且呈浓度依赖性。见表2、图1。

表2　各组BEAS-2B细胞分泌PEDF蛋白/GAPDH蛋白水平

图1　不同浓度PM 2.5刺激24 h后PEDF蛋白的Western blotting结果

3　讨论

PM 2.5是空气动力学直径小于2.5μm的大气细颗粒物，它不仅能沉积到肺泡，进入血液循环，而且能够携带某些化学物质及有机物，对人体造成极大伤害［7］。PM 2.5暴露不仅可以导致哮喘的始发，同时可以加重哮喘气道炎症，诱导哮喘患者急性发作［8］。同样，PM 2.5能够通过加重气道炎症及氧化应激损伤，引起慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）急性加重［9］。PM 2.5能够诱导肺泡上皮细胞以及肺泡巨噬细胞产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS能够激活下游的转录因子如核因子（nuclear factor，NF）-κB等，引起多种炎症介质和细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（nterleukin，IL）-8等，进而引起气道炎症反应加剧或延长，最终导致慢性重症气道炎症的形成［2］。

PEDF是一种多功能糖蛋白，在多个组织中均有表达，如肺组织、脂肪组织和心肌细胞等［4］。既往研究表明，在卵蛋白致敏哮喘小鼠，补充外源性PEDF蛋白能够抑制气道炎症及重塑，提示PEDF在支气管哮喘的发病机制中具有重要作用，其抑制气道炎症的作用机制可能与抑制血管内皮生长因子表达有关［3］。COPD患者血清中PEDF蛋白表达水平明显增高，其参与COPD的发病机制不明，可能通过促进相关炎症因子的释放，如IL-8、TNF-α、IL-6等［10］。多项研究表明，PEDF不仅具有抗炎、抗氧化等生物学特性，同时PEDF亦具有重要的促炎作用：小鼠脂肪细胞分泌的PEDF可活化巨噬细胞，引起TNF-α和IL-1β的释放，导致慢性炎症，其部分机制与激动细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 和p38丝裂原活化蛋白激酶（m itogen-activated protein kinase，p38MAPK）相关［4］；在人血管平滑肌细胞中，PEDF可以激活NF-κB途径促进炎症反应［5］。

本实验观察PM 2.5对BEAS-2B细胞中PEDF蛋白表达水平影响，结果显示，低浓度PM 2.5对BEAS-2B细胞PEDF蛋白表达无影响；而中、高浓度的PM 2.5能够显著增加BEAS-2B细胞PEDF蛋白水平，且呈浓度依赖性。其可能原因与其激动相关炎症信号通路如ERK1/2、p38MAPK等有关。具体机制有待进一步研究。

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Effectsof PM 2.5 on Expression of Pigment Epithelium-derived Factor in Bronchial EpithelialCells

ZHU Cheng-huɑ1，SHILi-jun2，ZHANG Ling-feng2，JIXiɑo-lɑn2，DU Qiɑng1
1.Departmentof Respiration Medicine，No.2 Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing，Jiangsu 210011，China；2.the Second ClinicalMedical Schoolof Nanjing MedicalUniversity，Nanjing，Jiangsu 210011，China
Correspondence to DUQiɑng.E-mail：jingshuyue@163.com

Objective To explore the effect of particulate matter（PM）2.5 on the expression of pigment epithelium-derived factor （PEDF）protein in bronchialepithelial cells（BEAS-2B）. Methods Human BEAS-2B were subcultivated，followed by low，medium and high concentrationsof PM 2.5（25μg/m l，50μg/m l，100μg/m l）stimulation for 24 hours.The expression of PEDF protein in supernatantwasanalyzed by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and the expression in BEAS-2B cells was detected by Western blotting.Results Compared with the control group，the expression of PEDF protein in supernatant and BEAS-2B cells induced by PM 2.5（25μg/m l）increased，butno significancewas found（t=-0.730，t=-1.840，P＞0.05），and the expression induced by PM 2.5 with the concentrations of 50 μg/m land 100μg/m lsignificantly increased（t＞5.798，P＜0.05）.Conclusion PM 2.5with the concentrationsof 50μg/m land 100μg/m l could increase theexpression of PEDFprotein in a concentration-dependentmannerboth in supernatantand BEAS-2B cells.

particulatematter；bronchialepithelialcells；pigmentepithelium-derived factor

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.10.008

R562.2

A

1006-9771（2016）10-1151-03

1.江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目（No.201410312015Z）；2.江苏省六大人才高峰项目（No.WSN-015）。

1.南京医科大学第二附属医院呼吸科，江苏南京市210011；2.南京医科大学第二临床医学院，江苏南京市210011。作者简介：朱成华（1986-），男，汉族，江苏淮安市人，硕士研究生，主治医师，主要研究方向：支气管哮喘的基础与临床。施丽君（1990-），女，汉族，江苏南通市人，硕士研究生，主要研究方向：支气管哮喘的基础与临床。朱成华和施丽君并列为第一作者。通讯作者：杜强，男，博士，副教授。E-mail：jingshuyue@163.com。

（2016-05-23

2016-07-19）