多重置换扩增在含抑制物检材中的应用

丁东雪，丁梅

（中国医科大学法医学院法医血清教研室，辽宁沈阳　110001）

多重置换扩增在含抑制物检材中的应用

丁东雪，丁梅

（中国医科大学法医学院法医血清教研室，辽宁沈阳110001）

目的研究多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）在含抑制物检材中的抗抑制能力，与磁珠法纯化检材相比较，证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合，分为MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组，PCR-STR单基因座D3S1358扩增联合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并应用AmpFℓSTR®IdentifilerTMPlus试剂盒联合毛细管电泳检测。结果血红素质量浓度大于1ng/μL或腐殖酸质量浓度大于0.1ng/μL时，空白对照组经单基因座STR检测不能得到扩增产物；磁珠法处理组血红素质量浓度大于100 ng/μL或腐殖酸浓度大于1ng/μL时，不能够得到扩增产物；MDA处理组各浓度抑制物均能成功扩增，完全不受抑制物影响。结论MDA技术可消除血红素及腐殖酸的抑制作用，其抗抑制能力优于磁珠法纯化DNA，具有一定的法医学应用意义。

法医遗传学；核酸扩增技术；多重置换扩增；抑制物；血红素；腐殖酸

犯罪现场提取的DNA样本常受载体所含抑制物（血红蛋白、纺织品染料、泥土中的腐殖酸等）的影响，致使PCR扩增失败。多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）技术，作为全基因组扩增技术之一，针对含抑制物检材，其反应体系中原始模板所占比例甚小，在模板被稀释的同时，抑制物亦被稀释，使其对扩增的影响明显减弱，甚至可以忽略不计［1］。此外，应用该技术进行扩增时，体系中的DNA量会随反应的进行而不断增多，抑制物的含量却保持不变，可以大大减少其抑制作用。本研究选择了两种较常见的PCR抑制物，应用MDA技术处理含抑制物样本，并与磁珠纯化法相比较，对该技术的抗抑制能力进行评估。

1　材料与方法

1.1样品

已知随机个体静脉血液样本2份，每份5mL，枸橼酸钠抗凝，-20℃保存。血液样本由中国医科大学法医血清教研室提供。

1.2主要仪器与试剂

3130xl型遗传分析仪（美国AB公司）。AmpFℓSTR® IdentifilerTMPlus试剂盒（美国AB公司），REPLI-g试剂盒［德国凯杰生物技术（上海）有限公司］，磁珠法微量基因组DNA抽提试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，血红素、腐殖酸（美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）。

1.3方法

1.3.1 DNA提取

取血样各1 mL，采用酚-氯仿法提取样品DNA，紫外分光光度法测量DNA质量浓度，用去离子水稀释到10ng/μL。

1.3.2含抑制物样品制备

用1 mol NaOH制备血红素储存液（5 g/L），加入盐酸中和至中性，用蒸馏水分别稀释为质量浓度1000、100、10、1、0.1、0.01 ng/μL，各取1 μL加入9 μL DNA样品中，制成含血红素抑制物样品。

用不同倍数蒸馏水稀释腐殖酸储备液，分别加入等量的DNA样品中，使其终质量浓度分别为100、10、1、0.5、0.1、0.01ng/μL。

将不同浓度的样品均分为3份，其中2份分别进行MDA（MDA处理组）和磁珠法纯化（磁珠法处理组），另1份不做任何处理（空白对照组）。

1.3.3多重置换扩增

1.3.3.1模板变性

将以上含抑制物样品取1μL（10ng）加入1.5μL的去离子水中，向样品中加入2.5 μL变性缓冲液D1（DLB缓冲液9μL和无菌水32μL），振荡均匀后短暂离心，室温放置3 min；加入5 μL中和缓冲液N1（终止液12μL和无菌水68μL），振荡混匀后短暂离心。

1.3.3.2扩增体系和反应条件

扩增体系为50 μL，包括29 μL REPLI-g缓冲液、1 μL REPLI-g DNA聚合酶，无菌水10 μL，变性后模板10μL。30℃等温全基因组扩增10～16h，65℃3 min变性，MDA产物用去离子水稀释50倍，-20℃保存备用。

1.3.4磁珠法纯化DNA

各取1μL含抑制物DNA样本，按照磁珠法微量基因组DNA抽提试剂盒操作手册进行纯化，得到的纯化产物置于-20℃保存。

1.3.5 PCR-STR

1.3.5.1单基因座D3S1358扩增及检测

分别以MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组的样本为模板，进行基因座D3S1358扩增（F：5′-ACTGCAGTCCAATCTGGGT-3′，R：5′-ATGAAATCAA CAGAGGCTTG-3′）。

扩增体系为20 μL：1×PCR缓冲液，rTaq聚合酶1 U，4种dNTP各0.2 mmol，上、下游引物各5 μmol，模板2 μL。扩增条件：94℃5 min；94℃30 s，60℃30s，72℃30s，循环30次；72℃10min。

用非变性聚丙烯凝胶（T=8%，C=3%）电泳检测扩增产物。电泳缓冲液均为1×TBE，160V电泳90min。10%GenefinderTM荧光染料20μL慢摇10min后，荧光染色显色，紫外光下观察结果。

1.3.5.2 STR复合扩增及检测

应用AmpFℓSTR®IdentifilerTMPlus试剂盒，以MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组的样本为模板，检测其复合STR分型结果。

采用10μL扩增体系，反应体系：MasterMix 4μL、Primer Set 2μL、去离子水3μL、模板DNA 1μL。热循环参数参照试剂盒的标准PCR扩增程序：95℃11min；94℃20s，59℃2min，72℃1min，循环29次；60℃10min。以DNA标准品9947A为阳性对照，TE缓冲液为阴性对照。

采用3130xl型遗传分析仪进行检测分析，采用GeneMapper ID v3.22软件计算片段长度和等位基因判型。等位基因的辨认通过与等位基因分型标准物（Ladder）比较来确定，窗口范围为±0.5bp。有效峰高定义为≥100相对荧光强度（relative fluorescence units，RFU）。

2　结果

2.1单基因座D3S1358扩增结果

2.1.1含血红素样品扩增产物检测结果

三组样品分别进行D3S1358基因座扩增后，得到的电泳检测结果如图1。空白对照组血红素质量浓度大于1ng/μL，无法得到扩增产物；磁珠法处理组质量浓度大于100 ng/μL时，无法得到扩增产物；MDA处理组各质量浓度均可得到良好的扩增产物。

2.1.2含腐殖酸样本扩增产物检测结果

三组样品进行D3S1358扩增结果分别见图2。空白对照组腐殖酸质量浓度大于0.1ng/μL，无法得到扩增产物；磁珠法处理组质量浓度大于1 ng/μL时，无法得到扩增产物；MDA处理组各质量浓度均可得到良好的扩增产物。

2.2 STR复合扩增结果

含血红素抑制物MDA处理前后的样品，复合扩增后均能得到完整的分型结果。当腐殖酸质量浓度为100 ng/μL时，空白对照组DNA样品复合扩增后，出现基因座和等位基因的缺失，无法得到完整的STR分型结果（图3）；经磁珠法处理后，出现基因座和等位基因的缺失，无法得到完整的STR分型结果（图4）；经MDA处理后，各位点均可以得到正确的STR分型（图5）。

3　讨论

3.1法医学PCR抑制物

在法医学实践中，常见的抑制物有土壤腐殖质、染料、色素、蛋白、尿素、单宁酸、胶原蛋白Ⅰ、多糖和胆盐等，这些常见的抑制物不仅会影响DNA提取时细胞的裂解、DNA扩增模板、DNA酶的活性等PCR反应的各个环节，而且在定量分析时有很大的干扰作用。血红素，又称为亚铁血红素，是血红蛋白分子上的主要稳定结构，在人类血液和肌肉中最为常见。在法医学中常见于陈旧的血痕，在进行血痕的DNA分析过程中，血红素最主要的PCR抑制作用就是可逆地阻碍聚合酶的活性位点，从而抑制DNA聚合酶的活性。腐殖酸，作为土壤中的常见物质，是从土壤里提取的检材中最为常见的抑制物，平均每克土壤含有5.00～7.63mg腐殖酸复合物［2］，土壤中游离的DNA能够很快地吸收并结合腐殖酸，由于腐殖酸具有与DNA核糖磷酸盐骨架上磷酸基团相似的理化性质，在DNA的提取纯化过程中竞争性结合DNA的吸收位点，因此在DNA提取过程中有土壤中的大部分腐殖酸都会与核酸同时提取出来。以往研究［3］表明，0.08ng/μL的腐殖酸就可以抑制最敏感的Taq聚合酶，0.5～17.0 ng/μL的腐殖酸可以抑制限制性内切酶。针对含抑制物检材的检测，传统的方法往往需要首先确定所含抑制物的种类，选择相应的方法进行抑制物的去除；当无法明确检材所含抑制物的种类时，往往采用稀释法。近年来广泛应用磁珠法可以通过对DNA样品进行纯化从而达到去除抑制物的作用，然而在纯化的过程中，不仅难以去除与DNA结构相似的抑制物，同时也会造成样品的损失，不利于后续遗传标记的分析。

本实验选择含血红素和腐殖酸抑制物的DNA样品作为研究对象，选取两种不同机制抑制物，以探求MDA抗抑制能力。结果表明，血红素在DNA样品中质量浓度为0.01～1000ng/μL、腐殖酸在DNA样品中质量浓度为0.01～100 ng/μL时，经过MDA处理后都可以得到相应的扩增产物。当血红素质量浓度超过100ng/μL或者腐殖酸质量浓度超过1ng/μL时，应用磁珠法纯化DNA无法得到相应的扩增产物。为了研究MDA在法医实践中的可行性，应用复合扩增试剂盒进行常规检测，由于AmpFℓSTR®IdentifilerTMPlus试剂盒对血红素有良好的抗抑制能力，其抗抑制能力达到500μmol，本实验设置的血红素质量浓度不足以抑制复合扩增。然而，在含腐殖酸抑制物样品中，当腐殖酸质量浓度大于100ng/μL时，未经处理样本无法得到完整分型结果；经过磁珠法处理的样品在纯化过程中不仅没有去除抑制物，而且出现了大量DNA的损失，没有得到扩增结果；经过MDA处理后，不仅得到了完整分型结果，且没有发现额外峰和过度扩增现象。血红素和腐殖酸两种抑制物不仅没有影响MDA的扩增效率，且针对其扩增产物进行后续STR分析时，MDA技术可以在保证扩增忠实度的前提下，消除该两种抑制物的抑制作用。

MDA技术是在恒温条件下以环状或线性DNA为模板，在有链置换活性和核酸外切酶活性的φ29DNA聚合酶作用下，通过耐核酸外切酶活性的随机引物与模板退火而进行扩增的一种全基因组扩增技术。其中，φ29DNA聚合酶是一种具有很强活性的高保真链置换活性的DNA聚合酶，具有低扩增偏倚、高扩增产物长度、低错配率和高DNA产量等特点［4］。Ballantyne等［5］的实验证实，使用GenomiPhi试剂盒进行MDA时，染料和腐殖酸均不会对扩增产生影响，但对含亚铁血红素的血样扩增成功率不高。本研究中抑制物并没有抑制该聚合酶的活性或者阻碍扩增反应的进行，由于其产物量稳定的特点，样品中DNA浓度增大，而PCR抑制物在50μL的扩增体系中稀释了50倍，使得抑制物浓度相对DNA浓度大大降低，其抗抑制物能力远远高于磁珠法纯化DNA。

3.2法医学应用

MDA技术在法医学疑难检材中有良好的应用前景，由于其良好的抗抑制物能力，可以被广泛地应用于含抑制物检材、微量检材和低拷贝检材。特别是针对多种情况并存的疑难检材，在进行遗传标记分析时应用该项技术进行前处理可以大大提高疑难检材的DNA检出率。本实验选取了具有代表性的两种PCR抑制物进行研究，针对其他种类的抑制物在常规STR检测中的效果，仍需要进一步探索和研究。

［1］刘维瑜，金春莲.多重置换扩增——一种新的全基因组扩增技术［J］.国际遗传学杂志，2007，30（4）：265-268.

［2］Tebbe CC，Vahjen W.Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast［J］.Appl Environ Microbiol，1993，59（8）：2657-2665.

［3］Alaeddini R.Forensic implications of PCR inhibition--A review［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（3）：297-305.

［4］Dean FB，Hosono S，Fang L，et al.Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（8）：5261-5266.

［5］Ballantyne KN，van Oorschot RA，Mitchell RJ.Comparison of two whole genome amplification methods for STR genotyping of LCN and degraded DNA samples［J］.Forensic Sci Int，2007，166（1）：35-41.

（本文编辑：李成涛）

Application of Multiple Displacement Amplification in Samples with Inhibitors

DING Dong-xue，DING Mei
（Department of Forensic Serology，Faculty of Forensic Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To explore the ability of inhibition resistibility of multiple displacement amplification（MDA）in samples with inhibitors.To explain the application and value of MDA in forensic medicine by comparing with using magnetic beads methods（MBM）to purify sample.Methods Different concentrations of hemoglobin and humid acid（HA）mixed with DNA samples and then divided the samples into MDA group，MBM group and control group.D3S1358 locus was amplified and detected by polyacrylamide gel electrophoresis detection system and AmpFℓSTR®IdentifilerTMPlus Kit-capillary electrophoresis detection system.Results When hemoglobin concentrations exceed 1ng/μL or HA concentrations exceed 0.1ng/μL，amplification products could not be obtained by single-locus system in control group.When hemoglobin concentration exceeds 100 ng/μL or HA concentrations exceed 1 ng/μL，the samples could not be amplified by MBM.Inhibitors in different concentrations were amplified successfully in MDA group without any influence from inhibitors.Conclusion MDA has the capability to remove the inhibition of hemoglobin and HA，which is better than MBM and has a certain value in forensic practices.

forensic genetics；nucleic acid amplification techniques；multiple displacement amplification；inhibitors；hemoglobin；humic acid

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.05.006

1004-5619（2016）05-0342-04

丁东雪（1988—），女，硕士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：dingdongxue1@hotmail.com

丁梅，女，教授，博士研究生导师，主要从事法医物证学研究；E-mail：dingmei1209@gmail.com

（2015-04-17）