黑斑蛙胰岛素样生长因子—2原核表达载体构建

刘乙雨+曾从涛+吴金芋+樊汶樵

摘要：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）是介导生长激素发挥生物学功能的重要因子，在动物机体的生长发育中具有重要作用。为对黑斑蛙IGF-2基因进行原核表达，本研究针对转录组数据中的黑斑蛙IGF-2序列，设计引物扩增IGF-2的完整基因，获得了全长为944 bp、ORF长为651 bp的序列；随后在黑斑蛙IGF-2的ORF两端添加限制性内切酶位点后亚克隆到pET-32a（+）质粒中，构建了黑斑蛙IGF-2的原核表达载体。为获得黑斑蛙IGF-2的表达产物并探究其生物学作用奠定了基础。

关键词：黑斑蛙；胰岛素样生长因子-2；表达载体构建

中图分类号：S855.1 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2016）08-0005-02

胰岛素样生长因子-2（insulin -like growth factors Ⅱ，IGF-2），又称生长调节素A，是一个单链多肽分子，与胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factorsⅠ，IGF-1）在氨基酸组成上具有同源性，并且二者都与胰岛素原（proinsulin）具有同源性[1]，故此得名。IGF-2是一个在细胞增殖、分化、程序性细胞死亡和转化中具有重要作用的因子，对个体生长、发育具有重要作用[2]。

黑斑蛙（Rana nigromaculata）俗称“青蛙”、“田鸡”；隶属于两栖纲、无尾目、蛙科；是我国分布最广的两栖动物之一，也具有较高的商业价值[3]。主要生活于海拔1 000 m以下的平原丘陵地区，多栖息于稻田、菜园、池塘、山沟等地；对环境适应性极强。本研究以黑斑蛙为研究对象，对黑斑蛙IGF-2基因进行克隆并构建原核表达载体，为下一步获得其表达产物及生物学功能鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

黑斑蛙生长在重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究中心的流水养殖系统中，挑选健康的成蛙，采用双毁髓法处死后取其肝脏组织，立即放入液氮中保存。

Trizol购自上海生工，Taq酶、pGEM-T质粒购自Promega公司，高纯质粒小量快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收及纯化试剂盒购自博迈德生物公司，感受态BL21（DE3）购自北京天根生化有限公司，XhoⅠ、BamH I 购自大连宝生物公司，酵母提取物、蛋白胨、Agar购自OXOID公司，pET-32a（+）由本室保存备用。氨苄青霉素50 mg/mL为本室自己保存备用。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据转录组数据库中IGF-2序列的保守区，利用Primer 5.0软件，设计一对特异性扩增引物（上游引物：5′-GCAACATCCAGC

AATACCACAGACGA-3′，下游引物： 5′-CTTTGGTG

TCTCAGTTTGCTCGTTT-3′）。引物并交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 cDNA制备 取液氮中保存的黑斑蛙肝脏。根据Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取，并利用Promega公司的cDNA合成试剂盒说明书完成cDNA的制备。

1.2.3 PCR扩增 利用高保真DNA Taq酶进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶回收试剂盒进行回收。阳性产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.4 IGF-2亚克隆引物设计 为了使IGF-2与pET-32a（+）质粒相连，在IGF-2片段上、下游引物分别引入BamH I和Xho I等限制性内切酶的识别位点并设计特异性引物（上游引物：5′-CGCGGATCC

ATGGAGCAACTAAGATGCAAAACCA-3′；下游引物：5′-GGCGAGCTCTCAATTATGGGAGGACTCTGA GTCT-3′）。引物交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.5 表达载体的构建 对1.2.3中获得的IGF-2全基因片段用高保真DNA Taq酶进行PCR扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶回收及纯化试剂盒回收，用BamH I和Xho I对扩增的IGF-2片段与pET-32a（+）质粒分别进行双酶切，酶切产物使用T4DNA连接酶连接并转化大肠杆菌BL21（DE）。阳性重组子用高纯质粒小量快速提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定；酶切结果送苏州金唯智生物科技有限公司测序鉴定。

2 结果

2.1 IGF-2全基因序列克隆结果

从黑斑蛙肝脏cDNA中克隆到约950 bp大小的基因片段，与预期产物一致，电泳结果见图1。该片段包含IGF-2基因全序列，包含651 bp的完整ORF。

2.2 IGF-2原核表达载体构建结果

由图2可知，提取的阳性重组质粒子经BamH I和Xho I双酶切后，出现约700 bp和5 900 bp的片段，与预期结果一致。

3 讨论

动物GH/IGF轴相关激素的效应对于机体生长发育具有至关重要的作用，其效应模式主要是由多种因子和多种调控模式组成了GH合成与分泌的调控网络。在该模式中，GH处于上游位置，而IGF 则处于下游位置，直接作用于靶细胞，介导GH 的生物效应[4]。其中，IGF-2的作用主要体现在加快细胞周期进程、调控细胞增殖、增加DNA的合成能力和血管的合成能力[5]。目前已经证明IGF-2与瘦肉率、脂肪积淀等许多经济性状有关[6]。近年来IGF-2与多种疾病的关系已经引起了极大关注，相信随着对其研究的深入，将有助于人类控制自身的疾病，也能为临床诊断、治疗带来新思路[7]。

目前关于IGF-2的研究多在于哺乳动物，两栖类IGF-2报道很少，有鉴于此，本实验以黑斑蛙IGF-2为研究对象，获得了阳性重组质粒。为下一步探究IGF-2在pET-32a（+）质粒中最优表达条件的筛选、表达产物的生物学活性测定奠定了基础；也为黑斑蛙IGF-2的临床应用提供了参考。

参考文献：

[1] POLLAK M. The insulin and insulin-like growth factor receptor family in neoplasia：an update[J].Nat Rev Cancer，2012，12（3）：159-169.

[2] PERRINI S，LAVIOLA L，CARREIRAM C，et al. The GH/IGFⅠ axis and signaling pathways in the muscle and bone： mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and osteoporosis[J]. J Endocrinol，2010，205（3）：201-210.

[3] 费 梁，叶昌媛，黄永昭，等.中国两栖动物检索及图解[M].成都：四川科学技术出版社，2005.

[4] CANOSA L F，CHANG J P，PETER R E. Neuroendocrine control of growth hormone in fish[J].Gen Comp Endocr，2007，151（1）：1-26.

[5] 彭凤兰.胰岛素生长因子2（Igf2）研究进展[J].实用预防医学， 2007，14（6）：1963-1966.

[6] 王丁科，阎 萍，梁春年，等.胰岛素样生长因子2研究进展[J].动物医学进展，2008，29（7）：67-70.

[7] 朱 婵.IGF2的生物学特性及其与疾病关系的研究进展[J].国际检验医学杂志，2010，31（9）：966-969.