代谢组学技术及其在针灸临床疗效机制研究中的进展

陈勤　吴巧凤　方剑乔

【摘要】 代谢组学是一种具有整体研究功能的组学研究方法，在针灸学机制研究中具有良好前景。随着针灸临床疗效机制研究与代谢组学技术结合的不断深入，寻求一种符合代谢组学研究方法并兼顾针灸效应特点的研究策略显得尤为重要。笔者对近10年针灸代谢组学研究进展进行分析，并提出针灸临床疗效研究与代谢组学技术结合的几点建议。

【关键词】 代谢组学； 针灸； 作用机制； 针灸现代化

Progress of Research on the Technology of Metabolism in Acupuncture and Moxibustion/CHEN Qin， WU Qiao-feng， FANG Jian-qiao.//Medical Innovation of China，2016，13（04）：138-141

【Abstract】 Metabonomics is a kind of whole function research group study method， which has a good prospect in the research of the mechanism of acupuncture and moxibustion. Along with the deepening of clinical therapeutic effect of acupuncture and moxibustion on the mechanism and metabolic omics technologies combined with and seek a meet the metabonomics research methods and taking into account the effect characteristics of acupuncture and moxibustion research strategy is particularly important. The author of nearly 10 years the metabolism of acupuncture and moxibustion group research analysis， and put forward the clinical therapeutic effect of acupuncture and moxibustion research and metabolic group science and technology combined with some suggestions.

【Key words】 Metabolism； Acupuncture and moxibustion； Mechanism study； Modernization of acupuncture and moxibustion

First-authors address： The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.04.040

代谢组学（Metabonomics）是上个世纪末继基因组学（Genomics）、转录组学（Transcriptomics）、蛋白质组学（Proteomics）之后发展起来的一门新的组学[1-2]。其基本定义“在生物体新陈代谢的动态进程中，通过系统分析生物的体液、组织中的内源性代谢产物谱的变化，来系统研究生物体整体受到外部刺激后的生物状况和调节功能”。近年来，与诊断学、药（毒理）学相关的代谢组学研究发展较快，其中具有代表性的有肿瘤、心血管疾病早期诊断，糖尿病发病因素研究，遗传性疾病研究等[3-7]。

近10年来，国内学者将代谢组学研究手段引入针灸研究领域，并利用代谢组学技术对消化系统疾病、神经系统疾病、风湿免疫性疾病等针灸临床常见疾病的针灸疗效代谢机制进行初步研究。本文对近10年代谢组学在针灸学研究中的进展进行综述，并提出自己的见解。

1 针灸机制研究与代谢组学技术结合的必要性

代谢组学就是在生物体新陈代谢的动态进程中，通过系统分析生物的体液、组织中的内源性代谢产物谱的变化，来研究生物体整体受到外部刺激后的生物状况和调节功能。与基因组学、蛋白质组学相比，它所关注的是生物体内基因和蛋白的有效变化所产生的最终代谢物质。代谢组学从最终代谢产物出发，追溯生物体内糖、蛋白质、脂类物质的代谢变化与疾病发生发展过程的关系，不仅可对疾病的衍变做到时-时追踪，与基因组学和蛋白质组学相比较，在对疾病相关性最强的信息（靶点）筛选上较前两种组学更为便捷。

针灸治疗作为一种外源性刺激，通过刺激生物体不同组织结构（皮肤、肌肉、血管、神经等）诱发信息传导及生化调节网络的变化，作用具有多途径、多层次、网络化的整体特点。以往的针灸机制研究方法多采用单条或多条途径、一个或多个靶点的研究方式进行研究，但往往难以涵盖全部针灸信号系统，正如针灸基础理论中，经络的内涵不仅包括腧穴（刺激点），同时还包括“经脉、络脉、经筋、皮部”等多个信号系统。因此，采用既往的微观研究方法往往在获得一组有效信息的同时会遗失针灸效应中其他的重要信息。

从代谢组学的特点来看，它研究的是外源性刺激情况下生物体系（细胞、组织或生物体）调整过程中，基因和蛋白的有效变化所产生的最终代谢物质。能够通过高通量的代谢物质筛查对针灸的效应产物进行观察，使研究者在同一时间段内获取尽可能多的生物信息，为针灸效应的整体化研究提供新的契机。

2 代谢组学技术与针灸机制研究结合研究现状

笔者通过文献检索发现，近10年针灸代谢组学已有一定发展，并形成初步成果，但研究仍存在以下问题。

2.1 研究病种 近10年吴巧凤等[8]研究团队利用代谢组学技术开展了较为系统的针灸机制研究，对功能性消化不良患者进行针刺治疗并采用核磁共振（NMR）技术进行代谢组学观察[8-11]，研究结果显示，针刺组与服用依托必利比较，乳酸、葡萄糖和乙酰乙酸的含量提高，西药组则主要表现为降低胆碱、亮氨酸/异亮氨酸的水平，说明针灸与药物治疗机理有所不同。其等还利用动物模型先后开展电针治疗溃疡性结肠炎、慢性情绪应激焦虑研究，发现电针能够调整溃疡性结肠炎、焦虑模型大鼠的一般状况，减轻溃疡性结肠炎大鼠肠道黏膜炎性细胞浸润，稳定线粒体、内质网等细胞结构同时能够调节大鼠血浆及大脑皮层代谢物含量[9-10]。但其研究病种集中于消化系统的功能性消化不良与溃疡性结肠炎，未对针灸临床常见疾病如胃炎、肠易激综合征、便秘等进行研究，对针灸治疗同类疾病的机制横向比对造成一定困难。

另外，张景雪等[12]观察隔药灸脐针三阴交与针三阴交对原发性痛经患者的血浆与尿液代谢产物影响，结果显示隔药灸脐针三阴交组可以直接通过提高一氧化氮、神经降压素，降低缩宫素、组胺的含量来缓解痛经。Wen等[13]采用基于超高效液相色谱质谱（UPLC拟MS）代谢组学技术分析急性痛风性关节炎大鼠的尿液和血浆，研究结果显示针刺可以改善急性痛风关节炎大鼠的血浆及尿液内的代谢物水平。任超展等[14]采用不同针刺手法对类风湿性关节炎（RA）家兔进行治疗并做代谢组学观察，研究结果提示热补针法治疗RA使尿液代谢物谱向正常回归的调控优于捻转补法、平补平泻手法治疗组。郭玲玲等[15]采用电针对SAMP8小鼠进行治疗，观察血浆、肝肾组织代谢物变化，研究结果提示电针对血浆、肝、肾组织的代谢谱图分别产生不同影响。以上研究病种分散，涉及到妇科、风湿免疫、神经系统多个方面，对针灸疗法的特征信息提取造成困难。

2.2 代谢组研究的标本 随着代谢组学研究技术的发展，多种生物液体和组织均可用于代谢组学检测。血浆和尿液样本由于收集简单、易于长期检测和包含大量的代谢信息，已经成为针灸代谢组学研究“整体模式”常用的标本。如吴巧凤等[11]检测健康男性针刺前后血浆、尿液代谢物浓度，发现针刺足三里、梁门、巨髎等阳明经穴可提升中糖类物质的浓度和降低乳酸浓度，升高尿液中马尿酸和氧化三甲胺的含量。陈勤等[16-17]检测偏头痛大鼠模型针灸治疗前后血浆代谢物，发现少阳经腧穴电针治疗能够降低偏头痛大鼠血浆谷氨酸、乳酸水平。张景雪等[12]观察隔药灸脐针三阴交与针三阴交对原发性痛经患者的血浆与尿液代谢产物影响。Wen等[13]采用基于超高效液相色谱质谱（UPLC拟MS）代谢组学技术分析急性痛风性关节炎大鼠的尿液和血浆代谢物水平。

但应注意，由于血浆或尿液只能代表生物体的平均代谢状态或代谢组，不能获得具体组织的代谢状态，因此代谢组学研究的组织应注意局部与整体相结合。如吴巧凤等[9]在电针治疗溃疡性结肠炎研究中，检测大鼠血浆代谢物同时检测大脑皮层代谢物含量。郭玲玲等[15]采用电针对SAMP8小鼠进行治疗，观察血浆、肝肾组织代谢物变化，研究结果提示电针对血浆、肝、肾组织的代谢谱图分别产生不同影响。

从研究目的看，疾病的自然病程和针灸效应二者演变是一个动态过程，采用尿液作为研究样本的代谢组学研究可以在不干扰生物体的情况下完成对生物体内物质变化的客观观察，追踪疾病和治疗手段的时-效关系，但尿液作为代谢组学研究样品，其代谢物含量受饮食、运动及环境影响极大，存在不稳定性，因此在代谢组学“时-效”研究中加入具有稳定特征的代谢样品（如关节液、脑脊液、组织器官等）的研究策略更具有科学性。

2.3 研究类型 总结近10年针灸代谢组学文献，仅有2个针灸代谢组学研究观察了来自于临床的真实患者。进一步分析临床试验所占比较较低的原因，考虑目前代谢组学临床研究的困难主要来源于以人为研究对象的代谢组学研究混杂因素过多，存在于生物样品的内在差异导致研究系统的稳定性和可控性降低。但由于不同生物物种之间存在明显差异，因此以动物实验为基础的研究结论需经过多次重复验证才能够直接运用于临床，不仅延长了研究时间，也消耗了大量的人力物力。因此，建立一种严谨且可行的针灸代谢组学临床研究策略，是针灸疗效机制研究与代谢组学技术的结合的关键步骤。

3 讨论

尽管目前代谢组学检测技术、数据分析方法及数据预处理软件发展迅速，仍没有任何一个研究系统能够完全、准确解释和分析研究结果的变异性，进一步影响了代谢组学研究结果的可靠性和客观性，并增加了代谢组学研究的难度[18-19]。

代谢组学研究结果的变异性主要来源于生物样品的内在差异和检测方法的系统误差。在代谢组学研究发展的前期，针对检测方法、实验样品预处理方法等研究较多，目前关于血清、血浆、尿液、关节液、唾液等常见组织液样品的采集、灭活、储存、处理和仪器分析过程的基本规范化技术参数已较为成熟，系统误差已明显降低。而存在于生物样品的内在差异处理和矫正仍是临床研究的一大难题。21世纪以来，以正交信号校正（Orthogonal signal correction， OSC）为代表的，具有滤噪、提高模式识别功能的谱学信号校正技术和数据预处理软件发展迅速。但不同的软件对标准品和实际生物样品图谱峰对齐的准确度仍存在差异，实际工作中需选择多种不同软件处理图谱，并进行交互验证，手工核对，降低了代谢组学研究的效率。因此，如何严格控制混杂因素对实验结果的干扰，建立规范、客观和可信的实验研究规范是代谢组学应用于临床研究的重要保障，也是代谢组学结果作为临床评价指标的前提条件。

笔者从事针灸临床研究多年，曾有幸参与代谢组学研究工作，在研究过程中发现针灸临床研究与药物临床研究具有明显差异，因此其研究方法较药学研究方法应有所区别，现简述如下，求正同道。

从针灸刺激产生的代谢物质信号看。针灸治疗作为一种“外治”法，针灸效应的产生，不同于药物的干预，其信号强弱取决于内在的疾病和外来的腧穴刺激共同作用，故人体反应能力的高低、疾病状态对研究结果的影响较其他研究更为显著。从前期代谢组学技术在针灸机制研究领域运用情况看，针灸确实能够引起人体血浆、尿液内代谢产物表型改变，而其引起的代谢物质的变化往往与生物信号传递、能量转化等基础生命过程相关；与药物实验相比，针灸刺激引起的代谢物质变化可能缺乏固定的物质特征与量-效关系，而与疾病信号关联性更高，因此在数据分析时了解疾病的代谢特征尤为重要[10-14]。

在代谢组学研究中，降低生物样品自身携带的与研究目的无关的信号差异，无疑是降低生物样品变异更好的方法。如在临床研究中限定研究对象的来源，如住院或门诊，疾病亚型与兼杂症，受试者年龄、性别、人种、体重指数、饮食、活动量、昼夜节律及生理周期等。而在临床实践中，必须兼顾患者群体代表性与伦理学要求，不同受试者个体生活习惯上的差异往往难以避免。针对这一情况，目前代谢组学临床研究多采用健康志愿者作为研究对象或对照；或增加实验样本量，降低个体差异对于实验结果的影响。但笔者认为，以健康志愿者作为对照，并不能完全模拟疾病的休止状态，而来源于研究对象的生理变异，也应在数据分析同时得到评估；目前代谢组学检测费用仍较为昂贵，仅靠实验样本量的增大来消除无疑会增加实验成本，降低该研究方法的临床可行性。

针对以上问题，笔者提出以下建议：首先，在针灸代谢组学临床研究方案中增加利于结果对比的临床方法设计。如在稳定性慢病中采用交叉实验或分层分析、配对分析，在发作性疾病研究中进行重复测量、连续测量，降低受试者个体差异对结果的影响。其次，在临床研究中增加滤噪和矫正处理。筛选可能影响实验结果的混杂因素，采用具有滤噪作用的实验设计方案，如正交实验设计，同时观察实验因素与非实验因素对实验结果的影响；通过实验结果分类，完成主、次要因素分析，进一步进行数据矫正分析，同时可减少不必要的样本量消耗。再次，选择合理的研究样品。从实验样品的筛选看，尿液、血液是最容易采集也是最易受饮食、运动、昼夜节律等非实验因素影响的实验样品，因此对于非住院患者、兼杂疾病较多的患者进行尿液、血液代谢组学分析，结论应谨慎。关节炎、组织液等实验样品受非实验因素影响相对较低，在采集条件允许的情况下，可优先考虑采用。必要时，可通过整合代谢组学（Integrated metabonomics）方法[20]，对同一个体的多种生物样品（尿液、血液、组织液等）进行代谢组学数据比比对和综合评价，提高代谢组学研究结果的完整性和准确性。最后，治疗性研究中，应注重将组学研究数据与临床疗效评价数据相结合，以提高说服力和寻找代谢靶标的成功率。

代谢组学可以在不干扰（采取尿液、唾液等样本）或有微量干扰（采取血液样本）生物体的情况下完成对生物体内物质变化的客观观察，追踪疾病和治疗手段的时-效关系，反映生物的整体变化，在针灸的机制研究中具有良好的应用前景。代谢组学技术与针灸疗法结合的研究策略还有待进一步探索。

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（收稿日期：2015-12-25） （本文编辑：王宇）