快速高效的半边莲组织培养体系研究

刘柏玲　李守洁　张凯　郭志军　张香蕊　王康满　侯元同

摘要：为保护和利用半边莲种质资源，建立快速高效的组织培养体系，本研究以野外采集的半边莲顶芽和茎段为外植体，利用Ms培养基为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA，研究半边莲合适的芽诱导和生根培养基。结果表明，半边莲的最适芽诱导和生根培养基分别为Ms+2.0mg/L6-BA和Ms+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，其芽诱导率和生根率分另0为97.0%和95.5%，组培苗长势好，移栽成活率达100%。本研究建立了半边莲快速高效的组织培养体系，为其资源的保存和利用提供了技术保障。

关键词：半边莲；组织培养；芽诱导率；生根率

中图分类号：S567.23⁺9+Q813.1⁺2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0018-03

半边莲Lobelia chinensis是桔梗科Campanu-laceae半边莲属Lobelia多年生草本植物，具利尿消肿、清热解毒之功效，常用于治疗痈肿疔疮、臌胀水肿、湿热黄疸、湿疹湿疮、蛇虫咬伤等，民间有“识得半边莲，不怕同蛇眠”之说，是《中国药典》2010年版收录的常用中药品种。半边莲又因其植株低矮、分枝多、叶密集、花形独特、色泽艳丽、观赏价值高而成为花坛、园林镶边、组合盆栽和观赏草坪的常用植物。半边莲在《山东植物志》和《山东植物精要》中的记录分布地区仅在肥城、临沂和枣庄，通过微山县的药用植物调查发现济宁为半边莲的新分布区域。由此可见，半边莲在山东省内分布较稀少，值得对其进行原地或迁地保护。半边莲的应用价值被逐渐发掘，而其生长环境人为破坏严重致使野生资源匮乏，因此利用组织培养技术研究半边莲的离体繁殖和种质保存就显得尤为重要。近年来，有人对半边莲组织培养进行了相关的研究，如阮淑明对半边莲顶芽和茎段进行培养；谭兴等利用TDZ诱导半边莲进行离体快速繁殖；王广军以半边莲的茎段和叶片诱导愈伤得到再生植株。本试验在前人研究基础上简化其培养过程，利用半边莲的顶芽和茎段在添加6-BA和NAA的MS培养基中成功培养后再移栽，建立了简单、快速、高效的半边莲组织培养体系，可为工厂化大量繁殖半边莲植株提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

半边莲于2014年4月采自于微山县薛河大桥东北侧，并成功种植在曲阜师范大学植物学实验室。选取长势良好的半边莲顶芽和带腋芽的茎段作为试验材料。

以MS培养基为基本培养基，添加3%的蔗糖、0.6%的琼脂，pH值用1mol/L的NaOH调至5.8～6.0，高压灭菌（1.1MPa、121℃）20min。培养温度为（25±1）℃，光照强度为1500～2000lx，光照12h/d。

1.2 试验方法

1.2.1 材料消 毒取半边莲顶芽和带腋芽的茎段，加适量洗洁精清洗后流水冲洗15min，置于超净工作台；70%乙醇消毒10s后无菌水冲洗2次，再用0.1%的升汞（HgCl₂）溶液消毒1min，期间不断摇匀；最后用无菌水冲洗3～5次，每次2～3min，无菌滤纸吸干外植体表面的水分，顶芽切掉基部、茎段切成1.0cm左右备用。

1.2.2 初代和芽诱导培养 经消毒的外植体接种到MS初代培养基中，30d后接种到芽诱导培养基中，30d后统计芽诱导率，芽诱导率（%）=产生芽的外植体数/接种外植体数×100。每处理培养10瓶，每瓶4个外植体，重复3次，试验结果为3次重复的平均值（下同）。

1.2.3 生根培养 将2～3cm左右的芽切下，移至生根培养基中，30d后统计生根率、根数量和根长。生根率（%）=（生根的芽数量/接种芽数量）×100。

1.2.4 驯化移栽 移栽前打开瓶盖进行炼苗，瓶内加入少量自来水，在培养室内放置2d。然后取出组培苗，洗净根部的培养基，定植于含腐殖土的小容器中，适当遮荫保湿。

1.3 数据分析

利用SPSS19.0统计分析软件进行方差分析和Duncans检验。

2 结果与分析

2.1 半边莲的初代培养

在本研究中，半边莲外植体在MS培养基中培养即能使顶芽和腋芽萌发，10d左右外植体基部开始形成根系，30d左右即能形成4～5cm长的小苗。

2.2 6-BA对半边莲芽诱导的影响

为繁殖大量的组培苗，将半边莲初代培养的茎段接种到芽诱导培养基（表1）中，30d后统计诱导率。结果表明：三种培养基的芽诱导率都较高，并且都能使试管苗长高、增粗。MS+2.0mg/L6-BA培养基中的芽诱导率和试管苗高度显著高于其它处理，芽诱导率达97.0%，平均苗长为4.7cm，并且能形成少量的根系（图1A）。

2.3 生根培养

为得到根系生长良好的组培苗，在MS+2.0mg/L6-BA培养基中再添加不同浓度NAA使组培苗进一步生根（表2），2周后统计根的生长状态。结果表明：三种培养基的生根率都在90%以上，并且都能使根伸长。试管苗在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA培养基中生根明显优于其它两个处理，根的总体生长状态最好，生根数量多，平均根长最长，达4.8cm（图1B）。

2.4 移栽

在生根培养15d以后，每株试管苗都形成良好的根系，并且有白色的根毛，达到移栽标准。炼苗2d后，将试管苗基部的琼脂清洗干净再进行移栽，适当保湿和遮荫，移栽成活率可达100%（图1C）。

3 讨论与结论

本研究采用半边莲的顶芽作为外植体时，更易于诱导产生组培苗，并且长势更好，这可能是顶芽组织幼嫩、不含毒素、生长速度更快的原因。在园艺植物组培进行脱毒苗的生产时大多利用植物的顶芽或茎尖作为外植体。

半边莲在MS基本培养基中能形成组培苗，说明半边莲在离体培养下较易成活，但在培养基中添加植物激素后，生长速度更快，组培苗长势更好，提高了其繁殖效率。植物激素是植物组织器官分化的关键因素，形成器官的类型是由培养基中不同激素的相对浓度控制，而不是绝对浓度。6-BA是细胞分裂素，诱导芽的分化；NAA是生长素，促进生根。前人研究结果表明，6-BA/NAA的比值高时有利于不定芽的分化，而比值低时有利于不定根的形成，本研究结果和前人结论相似，最佳芽诱导培养基为MS+2.0mg/L6-BA，最佳生根培养基为MS+2.0 mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。

半边莲的试管苗从无菌、营养好、光照和温度适宜的条件转移到自然条件下需经历一个炼苗的过程，使它们逐渐适应外界环境，从而保证移栽的成活率。在保证空气湿度以及适当遮荫条件下，成活率达100%。

本研究建立了半边莲快速高效的组织培养体系，从外植体到移栽成活整个周期为6周左右，繁殖速度快、繁殖系数高。半边莲组织培养体系的建立为其资源的保存和利用提供了技术保障，从而可以规模化地利用这一观赏和药用价值兼具的湿地植物。