1株脓肿分枝杆菌临床分离株的鉴定

2016-11-19郭素芳王俊瑞范文兵王艳艳刘超梅

国际检验医学杂志 2016年20期

关键词：革兰脓肿菌种

郭素芳,王俊瑞,范文兵,王艳艳,刘超梅

(1.内蒙古医科大学附属医院检验科,呼和浩特 010050；2.解放军第二五三医院感染控制科，呼和浩特 010051)

·个案与短篇·

1株脓肿分枝杆菌临床分离株的鉴定

郭素芳1,王俊瑞1,范文兵1,王艳艳1,刘超梅2△

(1.内蒙古医科大学附属医院检验科,呼和浩特 010050；2.解放军第二五三医院感染控制科，呼和浩特 010051)

脓肿分枝杆菌；菌种鉴定； 16S rRNA

脓肿分枝杆菌是一种不产色素的快速生长的分枝杆菌，与龟分枝杆菌亲缘关系较近。在快速生长的分枝杆菌引起的疾病中，60%～80%的慢性肺病由该菌导致，该菌也是引起创伤后伤口感染的主要病原体。在我国有脓肿分枝杆菌造成肺部病变和软组织损害的报道[1-3]。

1 资料与方法

1.1 一般资料患者，男，74岁。因气短、咳嗽咳痰20余年，加重5 d，发热体温38.5 ℃伴有寒战，咳黄色黏痰入院。胸腹CT显示有肺炎，双侧胸腔积液，左侧加重并局部包裹，左肺下叶压缩性肺不张，肝右叶小囊肿，盆腔少量积液。胸腔置管引流出黄色脓性积液1 000 mL,送检进行常规、生化及一般细菌培养。培养6 d有革兰阳性球菌生长，抗酸染色阳性，疑似非结核分枝杆菌。

1.2 仪器与试剂 PCR仪(伯乐公司)；电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；血平皿购自天津金章公司。沙保罗培养基用英国OXOID公司干粉自配；聚合酶链反应(PCR)扩增引物试剂由上海生工合成，聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase，TAKARA)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取菌株DNA 严格提取按照试剂盒说明书进行，试剂盒由天根有限公司提供。收集沙保罗培养基上的新鲜培养物5～6 环，采用20 mg/mL溶菌酶作用30 min，蛋白酶K 及RNase A 破除细胞壁，去除蛋白、RNA 等物质，最后使用TE 溶解DNA 沉淀，-20 ℃保存备用。

1.3.2 产物PCR扩增反应体系：1 μL模板，1 μL 引物F，1 μL引物R，12.5 μL聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase，TAKARA)，9.5 μL dd H2O。16S rRNA 基因序列引物由上海生工合成提供。16S rRNA-27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；16S rRNA-1492R,5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′。PCR 反应条件：94 ℃，5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃，7 min。反应结束后其产物进行琼脂糖凝胶电泳，条件为1%的琼脂糖含1 μg/mL EB，缓冲液为1×TBE，电泳为100 V/cm 约30 min。相对分子质量标志使用DL 2000 Marker，结果分析使用凝胶图像分析系统。

1.3.3 PCR及分子测序技术及序列比对 PCR 产物的基因测序由上海生工基因科技有限公司完成，并与公共数据库(GenBank database,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行DNA 序列同源性比较，确定菌种类型。

2 结果

2.1 培养鉴定胸腔积液标本接种至血平皿、麦康凯平皿35 ℃、5% CO2培养，培养48 h血平皿、麦康凯平皿上均无肉眼可见的细菌生长。取血平皿原始接种区培养物涂片革兰染色，显微镜下见少量非常小的革兰阳性球菌,散在和串珠样排列，疑为慢性生长菌。转种血平皿继续培养4 d，转种血平皿可见直径约1 mm、灰黄色、圆形、光滑、边缘整齐且不溶血的大小相同的小菌落，麦康凯平皿上未见生长。涂片革兰染色阳性杆菌呈索条状，抗酸染色阳性，疑似快生长非结核分枝杆菌。见图1。

注：A 表示转种培养后抗酸染色；B 表示转种培养后革兰染色。

图1 菌株的培养鉴定

图2 16S rRNA 片段的PCR 扩增

图3 菌株16S rRNA 基因序列比对分析

2.2 DNA提取和PCR扩增取沙保罗培养基上生长对数期菌落，抽提菌株DNA；PCR 扩增16S rRNA 基因序列，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，16S rRNA PCR 扩增产物大小约1 500 bp。见图2。

2.3 测序分析对其PCR 产物进行测序并与http:blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行DNA 序列同源性比较，测序结果与脓肿分枝杆菌同源性达90%。见图3。

3 讨论

脓肿分枝杆菌为一种非结核分枝杆菌，该菌广泛存在于自然界，人和某些动物均可感染致病，至今尚未发现动物传染人或人与人直接传染的证据[4-5]。近年来，脓肿分枝杆菌引起人感染的报道越来越多，慢性呼吸道疾病患者是其易感人群[6]。本实验菌株来源于肺炎患者的胸腔积液，培养48 h未见细菌生长。因送检胸腔积液呈脓性且涂片可见大量的白细胞，故取原始接种区涂片革兰染色见少量革兰阳性球菌。继续培养4 d可见针尖大小菌落，因此对疑似细菌感染标本如培养48 h未见细菌生长时，认为取原始接种区标本涂片革兰染色镜检可避免一些慢性生长菌漏检。本研究脓肿分枝杆菌转种血平皿培养4 d可见菌落灰黄色，且随培养时间延长，颜色逐渐加深，与桂静等[7]报道一致。

传统菌种鉴定方法耗时长且准确性差，不能鉴定到种,同时要求实验人员对观察结果的判定具备高度的专业知识，才能得到可靠的结果。近年来，一些基于分子生物学的菌种鉴定方法已广泛使用，极大地提高了对该菌种鉴定的诊断水平[8]。PCR具有特异性和敏感性高、快速、简便、重复性好及易自动化等优点。PCR和DNA碱基序列测序技术迅速发展，对16S rRNA基因进行测序并与基因序列进行比对，可将分枝杆菌鉴定至种，成为鉴定分枝杆菌菌种的金标准[9-10]。

临床表现及病理等方面表明，非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌感染还是比较难以区别，在无菌种鉴定结果情况下，可能长期被误诊为结核病。由于其对常见的抗结核药物大多耐药，给临床治疗带来很大困难，故准确鉴别两者具有重要的临床意义[11]。该菌对抗结核药物天然耐药，不同菌种对药物敏感性也不相同，治疗方案与疗程应根据菌种而定[12-13]。因此，快速、准确地鉴定分枝杆菌菌种对于疾病诊断、治疗和控制具有重要的临床价值。

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