实时荧光定量聚合酶链反应联合检测6种性病病原微生物的研究

王晓东,王 然,李凤焕,向 鑫

(中国人民解放军第二五四医院检验科，天津 300142)



·临床研究·

实时荧光定量聚合酶链反应联合检测6种性病病原微生物的研究

王晓东,王 然,李凤焕,向 鑫

(中国人民解放军第二五四医院检验科，天津 300142)

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)同时检测多种性病病原体的可行性和临床意义。方法 采用FQ-PCR方法对716例患者生殖道标本的淋球菌(NGH)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、梅毒螺旋体(TP)、人乳头瘤病毒(HPV)6/11型及16/18型等6种微生物或亚型进行定量检测，并与定性聚合酶链反应(PCR)进行比较。结果 2种PCR方法对6种病原体检测的总符合率分别为94.83%、96.16%、95.29%、100%、94.37%、94.12%。阳性率差异分别为1.29%、1.45%、2.18%、0、7.04%、0.98%， HPV6/11-DNA FQ-PCR法阳性率高于PCR(P<0.01),其他5项指标检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。 阳性标本定量平均拷贝数对数分别为(6.71±3.36)、(5.56±2.48)、 (6.83±3.17)、 (4.89±3.52)、(5.75±3.13)、(4.95±2.68)。结论 FQ-PCR操作简便、快速，高效，并能准确定量,对性病的诊断、发展和预后监测、疗效评价、指导用药具有重要的临床意义。

聚合酶链式反应，荧光定量； 奈瑟氏球菌，淋病； 衣原体，沙眼； 支原体，解脲； 梅毒螺旋体； 乳头瘤病毒

实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测通常扩增不同目的DNA片段，设计不同的特异引物及温度参数，在同一扩增参数条件下，同时检测多种病原微生物[1]。有关调查显示，性传播疾病发病率在我国正逐年上升[2]，人群结构以中青年为主，与受教育的文化程度呈负相关，为性传播疾病得到及时、有效的治疗，以及加强流行病防控，因此选择快速、敏感、特异、高效的检测手段非常重要。

1 资料与方法

1.1 一般资料 716例标本来自2010年5月至2015年5月该院泌尿外科、妇科、皮肤性病门诊的泌尿生殖系统感染及有高危性接触史患者，男332例，年龄16～59岁，平均32岁；女353例，年龄15～51岁，平均27岁。

1.2 仪器与试剂 DA-7600 基因扩增仪及荧光定量PCR试剂，分别购自达安基因和华美生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板制备 女性宫颈及阴道分泌物拭子或男性尿道拭子的无菌试管中，加入1.5 mL生理盐水并旋涡混匀器,充分震荡，将混悬液倒入无菌EP管，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀加50 μL DNA提取液，混匀后置金属热浴,100 ℃ 10 min，10 000 r/min离心5 min，分别取5 μL模板DNA置入相对应的6种目的DNA荧光定量扩增管。

1.3.2 FQ-PCR扩增参数 包含引物、荧光探针、底物dNTP、Taq聚合酶、离子buffer和模板的反应体系50 μL，94 ℃预变性120 s，然后 94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,35个循环，72 ℃ 延伸过程读取荧光，扩增结束导入标准曲线，定量超过100 copy/mL为阳性。

1.3.3 PCR扩增参数 包含引物、底物dNTP、Taq聚合酶、离子buffer的40 μL PCR扩增体系内加入5 μL模板DNA，预变性98 ℃ 180 s，加入2 U Taq酶，94 ℃ 30 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,35个循环，72 ℃ 5 min。取扩增产物10 μL进行1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭做指示剂，5～6 V/cm电泳2 h,凝胶置254 nm波长紫外透照仪下参照,Maker 比对荧光条带位置。

2 结 果

2.1 FQ-PCR检测结果 716例标本申请6、5、4、3、2、1项性病病原体DNA检测，分别为43、62、207、365、369、286例。见表1。

表1 FQ-PCR检测6种性病病原体DNA结果

表2 FQ-PCR与PCR检测结果的比较[n/n(%)]

2.2 2种检测方法的结果比较 性病病原体DNA检出率依次为解脲支原体(UU)、6/11型人乳头瘤病毒(HPV)、淋球菌(NGH)、沙眼衣原体(CT)、HPV16/18型、梅毒螺旋体(TP)，与有关报道接近[3-6]。阳性率和定量拷贝值最高为UU，54例标本定量超过108copy/μL，阳性定量水平最低为CT，平均低于104copy/μL，最高上限未超过106copy/μL。在进行荧光定量检测的同时，从DNA模板分别随机抽取对应78、69、92、56、71、51份DNA模板，分别进行NGH、CT、UU、TP、HPV6/11、HPV16/18 PCR扩增，总符合率94.83%，阳性率差异1.29%；CT-DNA 总符合率96.16%，阳性率差异1.45%； UU-DNA总符合率95.29%，阳性率差异2.18%；TP-DNA 总符合率100%；HPV6/11-DNA 总符合率95.77%，阳性率差异4.22%；HPV16/18-DNA 总符合率94.12%，阳性率差异0.98%。 2种方法检测HPV6/11-DNA阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01),其他比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨 论

性传播疾病的病原微生物种类较多，常见的细菌感染主要是NGH，可引起泌尿生殖系统的急性炎性或化脓性感染[7]。本研究结果表明，感染率最高的病原微生物是UU，支原体无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性，不易细胞培养。感染泌尿生殖道的衣原体主要种类是CT，它是严格的活细胞内寄生的微生物，具有独特的发育周期。UU和CT引起的泌尿生殖道感染症状类似，是主要的非淋菌性尿道炎，依靠FQ-PCR准确诊断病原微生物，选择敏感药物有针对性地进行有效治疗。TP近年来在我国增长迅速，显性和隐性梅毒患者均可是传染源，且潜伏TP居多，已成为报告病例数较多的性病之一。HPV是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，能引起人体皮肤、黏膜的鳞状上皮增殖。最多见的是低危6/11型及高危16/18型，高危型HPV持续感染也已被证明是导致宫颈癌的主要危险因素[8-10]。近年来性传播疾病发病率越来越高，发病年龄却逐年降低。防治性病更应教导青少年尊崇传统的道德伦理观念，加强青春期正确性教育和性病预防知识，培养良好的卫生习惯，从根本上减少性传播疾病的发生。

FQ-PCR反应体系中有2条普通的特异性引物，1条荧光标记探针，这条探针的5′端和3′端分别标记供体荧光报告基团和受体荧光淬灭基团，探针完整时，供体报告基团发射的荧光能量传递给相近的受体荧光染料并被吸收，进而激发出另一波长并能同时淬灭供体基团发射的荧光；TaqDNA聚合酶不仅有延伸DNA的引物活性，还有5′～3′外切核酸酶活性，扩增循环过程中，Taq酶的外切酶活性将探针酶切降解，使报告和淬灭2个荧光基团分离，荧光信号得到释放，自动监测系统可接收到发射荧光，扩增目的DNA链越多，荧光分子释放越多，实现荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。由于PCR扩增指数时期，模板CT值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量依据。多种病原微生物在同一反应条件下同时进行扩增检测，显著提高效率，在保障敏感性和特异性的前提下，不仅检测出感染病原微生物的种类，而且提示局部病原微生物的感染量级水平，对病情发展和预后能够进行有针对性的治疗及监测。

[1]苏学飞，左中越，程钢，等．荧光定量PCR检测性病病原体的临床价值[J]．实用医学杂志，2001，17(6)：561-562．

[2]龚向东，叶顺章，张君炎，等．1991～2001年我国性病流行病学分析[J]．中华皮肤科杂志，2002，35(3)：178-182．

[3]Gupta V,Dhawan B,Khanna N,et al.Detection and biovar discrimination of Ureaplasma urealyticum in Indian patients with genital tract infections[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2008,60(1):95-97.

[4]周文明，赵建龙，杨森，等．DNA芯片检测泌尿生殖道病原体及耐药的研究[J]．中华皮肤科杂志，2005，38(2)：108-111．

[5]姚兵，杨岳琴，朱启锭．套式聚合酶链反应结合直接荧光法检测女性生殖道沙眼衣原体[J]．中华医学检验杂志，1998，21(6)：17-20．

[6]李彦，肖瑜，刘燕飞，等．泌尿生殖道解脲脲支原体与沙眼衣原体感染分析[J]．中华医院感染学杂志，2015，26(20)：4642-4644．

[7]金必文，扬丽，丁金龙．151株淋病奈瑟菌的耐药性分析[J]．中华医院感染学杂志，2013，23(10)：2504-2506．

[8]Stormo AR,Espey D,Glenn J,et al.Findings and lessons learned from a multi-partner collaboration to increase cervical cancer prevention efforts in Bolivia[J].Rural Remote Health,2013,13(4):2595.

[9]Zhao R,Zhang WY,Wu MH,et al.Human papillomavirus infection in Beijing,People′s Republic of China:a population-based study[J].Br J Cancer,2009,101(9):1635-1640.

[10]Jiang P,Liu J,Zeng X,et al.Association of TP53 codon 72 polymorphism with cervical cancer risk in Chinese women[J].Cancer Genet Cytogenet,2010,197(2):174-178.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.051

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1673-4130(2016)20-2919-03

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