微板速率法检测丙氨酸氨基转移酶的研究

高朝贤，朱玉兰，陈钰婷，李丽梅，张 文，刘征宇，杨学琴，惠长野△

(1.广东省深圳市职业病防治院病理毒理科 518020；2.广东省深圳国际旅行卫生保健中心医学实验室 518033)



·论 著·

微板速率法检测丙氨酸氨基转移酶的研究

高朝贤1，朱玉兰2，陈钰婷1，李丽梅1，张 文1，刘征宇1，杨学琴1，惠长野1△

(1.广东省深圳市职业病防治院病理毒理科 518020；2.广东省深圳国际旅行卫生保健中心医学实验室 518033)

目的 探讨全自动酶联免疫分析系统微板速率法检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)的方法评价和临床应用。方法 参照国际临床化学联合会(IFCC)的推荐方法，结合分析系统建立微板速率法，通过方法学试验，评价其线性、批内和批间重复性；比较823例体检者血清标本采用微板速率法与常规生化分析仪法检测ALT的结果，并评价方法的临床应用。结果 微板速率法检测ALT，在活性303 U/L以下具有良好的线性；批内和批间变异系数均小于1/5TEa，其检测结果与常规生化分析仪的相关性良好。结论 全自动酶联免疫分析系统微板速率法检测ALT，为大批量标本同时检测ALT和ELISA项目提供了很好的选择，值得临床推广使用。

丙氨酸氨基转移酶； 微板速率法； 酶联免疫分析

丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测是采供血机构献血者和出入境检验检疫机构法定的体检者必查项目之一[1-4]。ALT检测方法较多[5-6]。国际临床化学联合会(IFCC)和国家卫计委推荐速率法[7-8]。本研究基于速率法原理，结合全自动酶联免疫分析系统的特点建立一种快速检测方法(微板速率法)，并对该方法的线性、精密度、准确度等进行评价。为采供血机构和检验检疫机构筛查ALT提供一种更高效的检测方法。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 由深圳国际旅行卫生保健中心提供的823例出入境者血清标本，标准品由美国贝克曼公司提供，质控品购自RANDOX公司。

1.2 仪器与试剂 Genesis RSP 150/8全自动加样仪(瑞士Tecan 公司)，FAME 24/20全自动酶联免疫分析系统(瑞士Hamilton公司)，AU2700全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)；96孔微量反应板(北京万泰药业有限公司)，ALT速率法试剂(上海科华生物科技股份有限公司)，标准血清(美国贝克曼公司，批号：66300/0117，定值：85.6 U/L)，质控血清[英国RANDOX，批号：HN1530/740UN、HN1532/539UE，参考值：(38±9)、(133±27)U/L]。

1.3 方法 微板速率法检测ALT：96孔平底酶标板，设标准孔3孔，质控孔2孔(低值和高值各1孔)，留1孔空白，其他为待检标本孔，采用Genesis RSP 150/8全自动加样仪分别加标准血清、质控血清，标本血清各40 μL，试剂1加入200 μL。试剂2装入FAME 24/20全自动酶联免疫分析系统，设定第1次读板程序。试剂2加样量50 μL，加样速度为最快，试剂加完后立即读板，测定主波长340 nm， 参考波长620 nm。设定第2次读板的主波长和参考波长同第1次读板程序，不需加试剂。第1次读板完成后，取出酶标板，37 ℃孵育600 s后，进行第2次读板。导出检测数据，Excel处理算出标本检测结果。

1.3.1 线性试验 抽取ALT活性683 U/L(AU2700 全自动生化分析仪)的血清标本，使用生理盐水做2/3比例稀释成活度梯度683、455、303、202、135、90、60、40、27、18、12 U/L的11例标本，应用微板速率法检测ALT结果。

1.3.2 重复性试验 RANDOX质控血清2例，正常值和高值血清各1例，应用微板速率法连续重复检测20 次，评价该方法的批内重复性；每天检测1次，重复20 d，评价该方法的批间重复性。

1.3.3 对比试验 823例血清标本分别采用微板速率法和AU2700全自动生化分析仪的传统检测方法进行检测，分析2种方法的相关性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。绘制吸光度变化与ALT活性散点图，拟合ALT≤303 U/L的直线方程；描述批内、批间重复性试验的均值、标准差及变异系数；比较2种方法检测结果的相关性。

2 结 果

2.1 线性试验 ALT 活性在303 U/L 以下具有良好的线性， ALT与测得吸光度变化的拟合曲线为Y=0.003X+0.005 7，相关系数R2=0.998 3。超过303 U/L，吸光度变化偏离曲线，随ALT活性升高但吸光度升高不明显。见图1。

图1 微板速率法检测ALT线性试验

2.2 重复性试验 美国临床实验室改进法案修正案(CLIA′88)规定ALT允许总误差(TEa)为靶值的±20%，微板速率法检测ALT批内、批间变异系数均小于4%，小于1/5TEa。见表1。

表1 微板速率法检测ALT重复性试验

图2 微板速率法与生化分析仪法的对比试验

2.3 对比试验 2种方法检测823 例血清标本的结果具有良好的相关性，拟合线性回归方程为Y=0.989X+0.289，R2=0.993。2种方法检测823 例阳性结果显示，大于40 U/L阳性结果的符合率为99.88%。见图2和表2。

表2 2种方法检测ALT的结果比较[n(%)]

3 讨 论

IFCC推荐的ALT检测方法是速率法，其原理是L-丙氨酸和α-酮戊二酸在ALT的作用下生成丙酮酸和L-谷氨酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成L-乳酸，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化成为NAD+，NADH吸光度的下降速率和ALT的活力呈正比，NADH在340 nm处有特异吸收峰，测定其下降速率，即可测出ALT活性。该方法具有准确度高、重复性好的特点，在临床检测中应用广泛，但必须在生化分析仪上完成。与ALT一样，HBsAg和HIV等ELISA项目也是献血者和法定体检者的必检项目，采供血机构和出入境检验检疫机构通常需先用酶标仪完成ELISA检测再用生化分析仪完成ALT检测。本研究建立的微板速率法可使ALT与ELISA检测项目同时加样，并可同时利用全自动酶联免疫分析系统检测，1次可检测90例标本，10 min内完成，免除繁琐步骤，减少差错发生，同时也可避免不同仪器间多次检测的携带污染问题。

本研究微板速率法在ALT活性303 U/L以下时具有良好的线性，检测上限约300 U/L，检测ALT具有良好的批内和批间重复性，与传统生化分析仪法的结果比较，两者相关性很好，阳性结果符合率达99.88%。相关研究报道，微板ALT检测方法多数以赖氏法和丙酮酸氧化酶法为主，这2种方法由于检测的重复性差，特别是对高值标本的检测存在严重的偏离现象，目前已基本淘汰[9-11]。与其他改良的微板速率法比较，本研究只需检测2个点吸光度，操作更加简便[12]。

本研究微板速率法不同于连续监测的速率法，是加入试剂后吸光度与反应10 min后吸光度变化的2点速率，对该方法的深入研究结果表明，反应时间影响检测的重复性和线性范围。在实际操作中，很难做到每批标本的反应时间完全一致，因此需在每块微孔板上都设置标准品，计算K值。本研究在仪器、试剂等条件下，10 min反应时间的线性上限约300 U/L，超过300 U/L的结果检测会偏低，应当稀释后重新复查，不同实验室由于检测体系不同，检测的线性范围可能存在差异。微板在大批量标本检测中具有一定的优势，对单个或少量标本的检测并不是理想的选择。

综上所述，本研究建立的微板速率法具有操作性强、结果稳定可靠的优点，与传统生化分析仪法有较好的可比性。该方法可采用全自动酶联免疫分析系统使ALT与ELISA其他项目同时检测，值得临床推广应用。

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Study on microtiter plate kinetic method to detection ALT

GAOChaoxian1,ZHUYulan2,CHENYuting1,LILimei1,ZHANGWen1,LIUZhengyu1,YANGXueqin1,HUIChangye1△

(1.DepartmentofPathologyandToxicology,ShenzhenPreventionandTreatmentCenterforOccupationalDiseases,Shenzhen,Guangdong518020,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShenzhenInternationalTravelHealthcareCenter,Shenzhen,Guangdong518033,China)

Objective To investigate the clinical application of ALT detection based on microtiter plate kinetic method in the automatic enzyme immunoassay system.Methods By beference to the IFCC recommended kinetic method,microtiter plate kinetic method was established in the automatic enzyme immunoassay system of ALT detection.The linear,intro-batch and inter-batch duplicability of the method were evaluated.ALT test results of 823 samples with microtiter plate kinetic method and automatic biochemistry analyzer method were compared.Results Microtiter plate kinetic method had good linearity where ALT activity <303 U/L,the intra batch and inter batch variation coefficients < 1/5TEa.The detection results of the clinical samples were correlated with the biochemical analyzer.Conclusion Microtiter plate kinetic method to detection ALT in the automatic enzyme immunoassay system is an ideal method for simultaneous detection of ALT and ELISA in large batch samples,which is worth popularizing.

ALT; microtiter plate kinetic method; enzyme linked immunosorbent assay

高朝贤，男，主管技师，主要从事医学检验研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.015

A

1673-4130(2016)20-2841-03

2016-05-11

2016-08-11)