红景天对缺血心肌肾上腺髓质素表达的靶向作用

阿力木江·买买提江 李 勇 施海明 姜晓斐



红景天对缺血心肌肾上腺髓质素表达的靶向作用

阿力木江·买买提江 李 勇 施海明 姜晓斐

目的：探讨红景天对大鼠心肌梗死后血管新生过程中肾上腺髓质素(adrenomedullin, ADM)表达的调控作用。 方法：将8周龄雄性Wistar大鼠分为4组，正常对照组、假手术组、心肌梗死造模后生理盐水对照组(生理盐水组)及心肌梗死造模后红景天干预组(红景天组)。饲养1周后处死动物，摘取心脏制作石蜡切片，采用CD31免疫组化染色进行微血管标记染色；处死动物前留取血浆，采用ELISA法测定血浆ADM浓度；Western blot检测不同组心肌组织ADM的蛋白表达水平。 结果：与正常对照组、假手术组及生理盐水组相比，红景天组大鼠心肌梗死边缘区微血管密度明显升高；红景天组(1.06±0.01)及生理盐水组(0.52±0.09)的缺血心肌组织ADM蛋白表达水平较正常对照组及假手术组均明显升高(P<0.05)，红景天组较生理盐水组ADM蛋白表达水平进一步升高(P<0.05)；红景天组[(32.28±5.13)ng/L]和生理盐水组[(28.55±3.49) ng/L]血浆ADM水平较正常对照组及假手术组均明显升高(P<0.05)，但红景天组和生理盐水组之间无明显差异。 结论：心肌梗死后大鼠血浆ADM水平变化与心肌内不同步，红景天对ADM表达的上调作用主要在缺血心肌，具有一定的靶向性。

红景天；肾上腺髓质素；心肌梗死；血管新生

冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)是指通过药物、转基因或其他干预手段，加快缺血心肌新生血管的形成[1]。体内血管新生过程是由血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肾上腺髓质素(ADM)等多种促血管新生因子调控的。

ADM是一种心血管活性多肽,具有扩血管、抑制血管平滑肌细胞增殖等多种生物学效应[2]。目前研究发现ADM在心力衰竭[3]、心肌梗死[4]及肺动脉高压[5]等多种心血管疾病中具有明显的保护作用，这与其改善内皮细胞功能、舒张血管、抑制细胞凋亡及促进血管新生等多种保护性机制相关[6-8]。

红景天是生长于高寒低氧地带的植物，其耐缺氧作用的机制一直受到关注。红景天的药理作用广泛[9-10]，我们以往的研究证实红景天具有促缺血心肌血管新生的作用[11-13]，本研究初步探讨红景天对缺血心肌ADM表达的靶向作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

8周龄雄性Wistar大鼠24只(由复旦大学实验动物中心提供)随机分为4组：正常对照组3只，不进行任何干预；假手术组3只，开胸后仅在相应手术部位空穿1针后关闭胸腔,前两组动物只进行普通喂养；其余两组为心肌梗死造模组，根据干预药物分为生理盐水组和红景天组，每组9只。采用冠状动脉结扎标准方法建立急性心肌梗死大鼠模型[14],造模前7 d开始药物干预，每日清晨灌胃1次，每次2 mL干预药物，至造模后7 d，经股动脉采血5 mL，留存血浆后处死大鼠，取出心脏进行相关检验。

1.2 干预药物制备

大花红景天(上海雷允上大药房)块茎粉碎后水煎3次，药汁过滤浓缩干燥后制成干粉(1 kg红景天块茎制成红景天干粉211.59 g)，高效液相色谱-紫外检测法测定每克红景天干粉中含8.3 mg红景天苷。18 g红景天干粉溶解于300 mL蒸馏水中制备红景天溶液。

1.3 组织化学检测

大鼠心肌组织常规脱水石蜡包埋切片(厚度4 μm)，苏木素-伊红(HE)染色观察心肌细胞形态学特征；CD31免疫组化染色(SP法)进行微血管标记染色。×200视野下观察微血管密度。

1.4 ELISA检测血浆ADM浓度

大鼠处死前留取的血浆按照ADM酶联免疫试剂盒(上海源叶生物技术有限公司)标准步骤操作，450 nm波长测量吸光度(OD值)，绘制标准曲线并计算血浆ADM浓度。

1.5 Western blot检测心肌ADM表达

用含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液抽提组织蛋白，BCA法绘制标准曲线定量蛋白浓度并稀释配平。SDS-PAGE电泳法(10%分离胶、4%浓缩胶)分离蛋白并转移到PVDF膜，ADM抗体(1∶500,RD公司)、 β-actin(1∶2000，RD公司)抗体4℃过夜，二抗室温孵育1 h后显影。

1.6 统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK 法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天促缺血心肌血管新生

大鼠心肌梗死造模7 d后对心脏组织切片行HE染色，与假手术组相比，红景天组及生理盐水组光镜下可见梗死边缘区心肌凝固性坏死，间质水肿及中性粒细胞浸润明显，但红景天组和生理盐水组非梗死区镜下表现与正常对照组和假手术组相似，均未见明显异常，见图1。

CD31免疫组化染色后红景天与生理盐水两组梗死边缘区与非梗死区相比，梗死边缘区CD31染色阳性的棕褐色细胞(心肌微血管内皮细胞)较多；与生理盐水组相比，红景天组梗死边缘区棕褐色染色较密集，形成管腔较多；红景天和生理盐水组非梗死区与正常对照组及假手术组相似。见图2。

注：A为红景天组梗死边缘区；B为生理盐水组梗死边缘区；C为假手术组；D为红景天组非梗死区；E为生理盐水组非梗死区；F为正常对照组图1 各组大鼠心肌HE染色照片(×200)

注：A为红景天组梗死边缘区；B为生理盐水组梗死边缘区；C为假手术组；D为红景天组非梗死区；E为生理盐水组非梗死区；F为正常对照组图2 各组大鼠心肌CD31免疫组化染色照片(×200)

2.2 红景天促缺血心肌ADM蛋白表达

Western blot检测心肌组织ADM蛋白表达水平，结果发现红景天组和生理盐水组ADM表达水平较正常对照组和假手术组显著增加(P<0.05)，其中红景天组较生理盐水组ADM表达水平又有明显增加(P<0.05)，见表1。

2.3 红景天对心肌缺血大鼠血浆ADM水平无明显影响

表1 各组大鼠心肌ADM 蛋白表达水平

注：各组数据经K-S检验符合正态分布。与生理盐水组相比，(1)P<0.05；与假手术组相比，(2)P<0.05；与正常对照组相比，(3)P<0.05

采用ELISA法检测大鼠血浆ADM浓度发现，红景天组和生理盐水组大鼠血浆ADM水平较正常对照组和假手术组均有升高，且差异有统计学意义(P<0.05)，但红景天组与生理盐水组之间血浆ADM水平无明显差异，见表2。

表2 各组大鼠血浆ADM 水平/ng·L-1

注：各组数据经K-S检验符合正态分布。与生理盐水组相比，(1)P<0.05；与假手术组相比，(2)P<0.05；与正常对照组相比，(3)P<0.05

3 讨论

ADM是1993年由Kitamura等[15]在嗜铬细胞瘤中提取的一种具有强降压和扩血管作用的肽类物质，属于降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide ，CGRP)超家族成员。ADM广泛分布于心血管、呼吸道、肾脏、内分泌、生殖系统、肠道和免疫系统[16]，如此广泛的分布提示ADM在细胞功能调节中作用的多样性，循环中的ADM主要来源于血管内皮细胞。正常人循环中ADM水平很低，在发生心力衰竭、肺动脉高压、动脉粥样硬化、糖尿病等多种疾病时，血浆ADM水平明显升高[3-5]。

红景天为景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物，以往研究提示在急性心肌缺血过程中，红景天通过调节VEGF、FGF等血管新生相关因子的表达水平，促进血管新生[13]。本研究通过CD31特异性内皮细胞标记进一步证实红景天有促缺血心肌血管新生作用，这一过程同时伴随大鼠缺血心肌ADM蛋白表达的明显升高。本研究还发现心肌梗死大鼠血浆ADM水平明显高于假手术组，但与生理盐水对照组相比，红景天处理不影响血浆ADM水平，提示心肌缺血本身促进循环ADM的产生，但红景天对ADM的作用定位于缺血心肌本身而非全身系统性影响。鉴于ADM为促血管新生调控因子之一，本研究提示红景天促缺血心肌血管新生的作用可能与靶向调控心肌局部ADM水平相关。

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(收稿：2016-04-01 修回：2016-06-25)

(本文编辑：丁媛媛)

The targeting effect of rhodiola on the expression of adrenomedullin in ischemic myocardium

ALIMUJIANGMaimaitijiang,LIYong,SHIHaiming,JIANGXiaofei.

DepartmentofCardiology,HuashanHospitalaffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China

Objective:To explore the regulative effect of rhodiola on the expression of adrenomedullin(ADM) during angiogenesis of rats after myocardial infarction. Methods:The eight-week-old Wistar rats were divided into the normal control group, the sham-operated group, the saline group and the rhodiola group. They were sacrificed after one week feeding. Their hearts were resected and embedded in paraffin to make sections. Microvessels were marked with CD31 immunohistochemical staining. Plasma concentration of ADM was tested by ELISA before sacrifice. The protein expression levels of ADM in myocardial tissue among different groups were observed and compared by western blot. Results:The rhodiola enhanced the rat's microvascular density in infarcted border zones after treatment, showing significant difference as compared with saline group, sham-operated group and normal control group. The protein expressions of ADM in ischemic myocardial tissue after rhodiola (1.06±0.10) and saline treatment (0.52±0.09) were significantly higher than the other two groups (P<0.05), while rhodiola further up-regulated the ADM expression than saline (P<0.05). Plasma concentrations of ADM in rhodiola group [(32.28±5.13) ng/L] and saline group [(28.55±3.49) ng/L] were higher than those in the other two groups (P<0.05), while no significant difference was observed between rhodiola group and saline group. Conclusion:The rhodiola can up-regulate ADM expression in ischemic myocardial tissue. The change in ADM plasma concentration doesn't synchronize with the altered ADM expression in myocardial tissue after myocardial infarction. The up-regulatory effect of rhodiola on ADM expression is mainly focused on the ischemic myocardial, showing a targeting characteristic.

Rhodiola； Adrenomedullin； Myocardial infarction； Angiogenesis

国家自然科学基金(81573710)

200040 复旦大学附属华山医院心内科

姜晓斐，Email：sule_jiang@126.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.05.010