天蚕素A-马盖宁杂合肽体外抗白色念珠菌活性实验研究*

张爱君,王秀青,杨凤琴

(1.宁夏医科大学检验学院，宁夏银川 750004；2.宁夏检验医学研究所)



天蚕素A-马盖宁杂合肽体外抗白色念珠菌活性实验研究*

张爱君1,2,王秀青1,2,杨凤琴1,2

(1.宁夏医科大学检验学院，宁夏银川 750004；2.宁夏检验医学研究所)

目的：本实验旨在研究天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌的体外抗菌活性。方法：选取10株临床分离的白色念珠菌和其标准菌株，采用K-B法和肉汤稀释法测定天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌的抑菌效果和最小抑菌浓度。结果：天蚕素A-马盖宁杂合肽对11株白色念珠菌均有抑菌作用，且最小抑菌浓度测定为0.16 mg/mL。结论：天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌具有一定的抑菌作用。

天蚕素A-马盖宁杂合肽；白色念珠菌；最小抑菌浓度

白色念珠菌是寄生在人体皮肤、黏膜的正常真菌,也是临床上重要的条件致病性真菌。免疫力低下者可引起皮肤、黏膜及内脏的念珠菌病,重者可引起系统性感染,危及生命。近年来,随着抗真菌药物的广泛之用,耐药菌株也大量增加。而免疫抑制剂、广谱抗生素及皮质类固醇激素的广泛使用、导致医院内白色念珠菌病的发病率不断上升，成为目前临床上的焦点问题[1],同时给临床抗真菌治疗也带来困难。

抗菌肽是生物体经诱导产生的具有抗菌活性的一类小分子多肽，其分子质量小、构象简单、无免疫原性、不易引起耐药，且具有抗菌谱广、抗菌活性高等特点，很有可能成为新型抗微生物药物[2]。本实验通过体外抑菌试验测定天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌的抑菌活性。

1 材料

1.1 实验菌株 白色念珠菌(ATCC.10231),购于北京生物制品鉴定所。10株临床标本中分离的白色念珠菌由宁夏回族自治区某医院提供。

1.2 试验药品 人工合成的天蚕素A-马盖宁杂合肽。

1.3 培养基 沙保弱氏液体培养基、沙保弱氏固体培养基、MH液体培养基和MH琼脂培养基，均购自北京陆桥生物制品有限公司，使用时按使用说明配制，高压蒸汽灭菌备用。

1.4 仪器 AL-204电子天平(梅特乐科学仪器有限公司生产)；YQX-LS50A型全自动高压蒸汽灭菌器(上海申安科学仪器有限公司生产)；BHC-1300IIA/B3生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司生产)；DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司生产)。

1.5 方法

1.5.1 天蚕素A-马盖宁杂合肽的合成 是由本课题组前期研究、设计合成，并利用毕赤酵母表达系统进行表达的产物，具体方法见文献[3]。

1.5.2 菌悬液的制备 第一，取待测菌保存液10 μL加入1 mL沙氏液体培养基，置于37 ℃摇床过夜培养24 h。第二，对第一步培养液进行OD600值测定，沙氏液体培养基调整菌液浓度使其OD600值落在0.08～0.1之间，此时菌液浓度约为108CFU/mL。第三，上样菌液稀释。将待测菌液在第二步骤所得稀释倍数的基础上再稀释1 000倍，此时菌液浓度约为105CFU/mL，此时菌液即为上样菌液。

1.5.3 抗菌药物制备 参照美国临床实验室标准化委员会标准。用双蒸水作为抗菌肽的稀释液，天蚕素A-马盖宁杂合肽药物浓度20 mg/mL，溶解后用0.22 μm孔径的滤膜过滤。

1.5.4 天蚕素A-马盖宁杂合肽抗真菌活性的初步测定 采用纸片琼脂扩散法。(1)取两株白色念珠菌接种于沙氏琼脂平板，37 ℃培养24 h，然后挑取沙氏琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3 mL生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊，调整浊度至0.5麦氏单位。(2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个沙氏琼脂培养基表面，保证涂均匀。(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取无菌纸片贴在平板表面，每个平板贴2张纸片。用每张纸片间距≥24 mm，纸片中心距平皿边缘≥15 mm。在一张纸片上用加样枪加入抗菌肽4 μL(20 mg/mL)，另一张纸片用加样枪加入等量的生理盐水(40 μL)，作为阴性对照。(4)孵育24 h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。

1.5.5 待检药物最小抑菌浓度的测定 选择11株测试菌，对每1株进行如下操作：(1)取无菌96孔板第1～11列加入灭菌沙氏液体培养基100 μL；(2)无菌96孔板第1列加入抗菌肽(20 mg/mL)，逐次倍比稀释至第11列：(3)无菌96孔板每1孔加入菌液100 μL，终体积200 μL；(4)无菌96孔板第12列上两孔加200 μL/孔灭菌沙氏液体培养基做阴性对照，下两孔加200 μL菌液做阳性对照；(5)药液和菌液上样完毕后，盖好板盖，37 ℃温箱培养24 h，观察结果，以不生长细菌的最高药物稀释度为该药物对该种细菌的最小抑菌浓度。平行做3次，以两次或3次测定结果相同为准。

2 结果

2.1 K-B法体外抑菌试验结果 天蚕素A-马盖宁杂合肽对标准菌株-白色念珠菌有抑菌圈，直径为11 cm，表明天蚕素A-马盖宁杂合肽有抗真菌活性。如图1所示。

2.2 肉汤稀释法体外抑菌试验 天蚕素A-马盖宁杂合肽对临床分离的白色念珠菌及标准菌株表现出近乎相同的抑菌效果，其对白色念珠菌的平均最小抑菌浓度为0.16 mg/mL。详见表1。

表1 天蚕素A-马盖宁杂合肽对白色念珠菌的体外抑菌结果

注：+表示有细菌生长；-表示无细菌生长

3 讨论

近年来，真菌感染在住院患者的检出率逐渐升高，其感染率仅次于肠杆菌科细菌和非发酵菌。其中深部真菌感染，又称侵袭性真菌感染，指致病性真菌侵及人体表层以下的组织引起的疾病，严重时甚至可以导致全身性感染，危害性极大。而随着人口老龄化、艾滋病以及糖尿病发病率的不断上升。随着广谱抗生素、肾上腺皮质激索、抗肿瘤药物和免疫抑制剂等在临床中的广泛使用，以及骨髓器官移植、介入治疗等技术不断推广，致使许多患者的免疫力下降或缺陷，使得深部真菌感染的发病率和病死率呈急剧上升的趋势[4]。80年代初,第一个生物利用度高、可以口服使用的咪唑类抗真菌药物酮康唑应用于临床,不久就有应用酮康唑治疗念珠菌感染的患者出现耐药的报道。氟康唑开始在临床上应用后,由于口服易吸收,抗真菌谱广,作用强,生物利用度高,不良反应低等优点,很快取代酮康唑,广泛用于多种深部真菌感染的治疗,但很快出现了耐药的菌株,伏立康唑是三唑类抗真菌药,在体内、体外可抗多种致病真菌,但有研究显示三唑类抗真菌药物之间存在交叉耐药。

抗菌肽是生物体经诱导产生的具有抗菌活性的一类小分子多肽，是生物先天性免疫的重要组成成分。由于其分子质量都比较小，大约在18～35 kD之间，分子构象简单，一般不会引起机体的免疫反应。随着对抗菌肽结构、功能与杀菌机理研究的深人，人们开始尝试设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。Jaynes以天蚕素B为蓝本设计并化学合成的Shiva-1lq和Fink等固相合成法化学合成的杂合抗菌肽ADr4，其杀菌活性远远高于天然抗菌肽，抗菌谱也有所增加。目前抗真菌肽的抗菌机制未完全阐明，被广泛公认的学说之一是细胞膜破坏作用，即带正电的抗菌肽与带负电的微生物细胞膜产生静电吸引作用，抗菌肽通过破坏真菌质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，最终导致菌体裂解死亡。还有研究发现[5]抗菌肽对真菌的作用方式涡阳，如通过胞膜作用，与真菌细胞内线粒体、核酸大分子等重要细胞器的相互作用，最终导致真菌死亡。

鉴于此，我们设计合成了cecA-mag杂合肽的突变体天蚕素A-马盖宁杂合肽，通过K-B法和肉汤稀释法，用合成产物天蚕素A-马盖宁杂合肽对临床分离的10株白色念珠菌进行了体外抗真菌活性的测定。结果显示天蚕素A-马盖宁杂合肽具有一定的抑制真菌的作用，其最小抑菌浓度是0.16 mg/mL。但在动物体内抗菌肽药物浓度维持、抵抗温度、酸碱度对药效的影响等方面仍需进一步的研究。

[1] Mayer F,Wilson D,Hube B.Candida albicans pathogenicity mechanisms [J].Virulence，2013,4(2):119-128.

[2] 牛明福，李翔，伍家发.抗菌肽的分子设计研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008,(4)：2-5.

[3] Wang XQ,Zhu MX，Zhang AJ.et al.Synthesis and secretory expression of hybrid antimicrobial peptide CecA-mag and its mutants in Pichia pastoris [J].Experimental Biology Medicine,2012,237(3)：312-317.

[4] 刘灿,王中新.假丝酵母菌药敏检测方法及其耐药性的研究进展[J].安徽医药,2010,14(2):224-226.

[5] Magill SS ,Shields C,Sears CL ,et a1.Triazole crross-resistance among Candida spp:case report,occurrence among bloodstream isolates,and implications for antifungal therapy〔J〕.J Clin Microbiol,2006,44(2):529-535.

An experimental study on vitro antibacterial effects of cecropin A-magainnin hybrid peptide on candida albicans

ZHANG Aijun1,2，WANG Xiuqing1,2,YANG Fengqin1,2

(1.CollegeofLaboratoryMedicine，NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China; 2.NingxiaMedicalInspectionInstitute,Yinchuan750004,China)

Objective:To study vitro antibacterial effects of cecropin A-magainnin hybrid peptide on candida albicans.Methods：10 strains of candida albicans isolated from clinic and 1 standard bacterial strain were selected.Kirby-bauer (K-B) method and broth dilution method were adopted to determine the antibacterial effect and minimal inhibitory concentration (MIC) of cecropin A-magainnin hybrid peptide against candida albicans.Results：Cecropin A-Maganin has antimicrobial effect on the 11 strains of candida albicans with MIC measured as 0.16mg/mL.Conclusion：Cecropin A-magainnin hybrid peptide has antimicrobial effects on candida albicans to some extend.

Cecropin A-magainnin hybrid peptide; Candida albicans; Minimal inhibitory concentration (MIC)

宁夏医科大学校级面上项目(XM2012017)

2015-08-26)