功能性纳米材料在电化学免疫传感器中的应用

陈科陈素萍

（1. 湖南环境生物职业技术学院，湖南衡阳 421005；2.南华大学附属第一医院，湖南衡阳 421001）

功能性纳米材料在电化学免疫传感器中的应用

陈科1陈素萍2

（1. 湖南环境生物职业技术学院，湖南衡阳 421005；2.南华大学附属第一医院，湖南衡阳 421001）

免疫传感器是基于亲合作用，将选择性免疫反应与适合的信号转换技术结合起来，用以监测抗原-抗体反应的生物传感器，逐渐在许多领域得到快速发展和广泛应用。在近年来的电化学免疫传感器主要研究方向，大致上是提升灵敏度、精确性、选择性、加速反应时间，而本文将使用单壁纳米碳管当作电极，利用其具备良好的导电性、超高表面积比，透过改质后的纳米碳管管壁与管端可与生物分子键结，且保持生物分子的活性，极具电化学免疫传感器的象征意义。本文将具体结合相关理论和分析，对功能性纳米材料在电化学免疫传感器中的应用进行研究。

功能性 纳米材料 电化学 免疫传感器

免疫传感器的一般工作原理为固定在换能器上的抗体（抗原）对样品介质中的抗原（抗体）进行选择性免疫识别，并且产生随分析物浓度的变化而变化的分析信号。在抗体的不同区域和抗原决定簇之间的高选择性反应主要包括疏水力、静电作用力、凡德瓦尔力和氢键作用力。近年来纳米材料在电化学免疫传感器上的应用也发展得相当迅速。由于纳米材料具有表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高和吸附能力强等优异性质，将纳米微粒应用于电化学免疫传感器中，可以提高传感器测量的灵敏度、准确性、减少采血量和检测时间［1］。作为免疫分析技术的一个重要分支，免疫传感器除了具有传统免疫分析方法所共有的性能特点外，还具有高选择性、高灵敏度、可逆性和 詴剂利用的高效率等优点。另外，免疫传感器大都制备简单，便于实现自动化、数字化和微型化，因此可以避免传统免疫分析方法所附带的一系列问题，故在临床分析、环境分析和生物监测过程中显示了强大的应用潜力［2］。因为免疫传感器常用来测量源于分析物和固定的抗体/抗原之间的反应而产生的信号，所以将抗体（抗原）固定在原始换能器表面的固定化过程在免疫传感器制备中有着重要的作用。大量的固定法已用于各种免疫传感器，如静电吸附、包覆法、交联法、共价键结合法等。

1 电化学免疫传感器的工作原理

由于电化学免疫传感器具有高灵敏度、低成本和便携等优点，成为免疫传感器中研究最早、种类最多，也较为成熟的一个分支。电化学免疫传感器的基本工作原理是：采用电化学检测方法来检测标记的免疫 詴剂或一些由酶、金属离子和其它电活性物质标记的标记物，从而对疾病诊断或病人状态监测中复杂系统的多组混合物进行分析提供有力数据［3］。用于电化学免疫传感器检测中的换能器主要分为电位型、电导型、电容型、阻抗型和安培型等装置。电位型传感器现在已经被公认为是一种成熟的传感器，已有大量的商品化产品。对于电位型传感器，当电流流动为临界点时，换能器界面处于平衡状态，此时电极或者表面修饰膜的电位变化与溶液中特定金属离子活性呈对数比例关系，这就是电位型换能器的基本工作原理。这类生物传感器具备制备简单、操作容易及选择性良好的优点［4］。

2 功能性纳米材料技术

与块状物质相比，金属和金属氧化物纳米粒子由于其新颖的材料特性，近年来已被广泛研究。少于50个金属原子小团簇可以产生像大分子一样的效果，但大于300个原子的大团簇表现出大体积样品的性质，介于这两种极端之间的材料，通常为纳米材料，有许多未知的化学和物理性质，这也是许多研究一直集中于纳米材料的一个原因。纳米材料具有依赖于其尺度的光、电和化学性能［5］。纳米材料可以应用到许多领域，如光学器件、电子器件、催化、感测技术、生物分子标记等。考虑纳米粒子的优点，如大面积、高催化性和良好的亲和性，如今，多种纳米材料已被用来包覆蛋白质。常用的有纳米碳管（CNTs）、金胶体（Au colloidal）、量子点以及纳米二氧化钛。CNTs自从1991年被发现以来，引起了一股研究热潮。纳米直径的圆筒形石墨片状的CNTs具备高电导率、良好的化学稳定性、非常显着的机械强度和成模性。纳米碳管可以与DNA分子自组装（self-assembly）。根据理论预测与实验验证，DNA/CNTs 层可作为新的电子材料［6］。由于DNA溶液可以胶化，混合的DNA/CNTs层能够在金属电极表面保持稳定，可以用来研究一些电化学现象或检测一些蛋白质性质。此外，带正电荷的蛋白质可被固定在带大量负电荷的DNA修饰层上。多壁纳米碳管与DNA混合后，可成功地固定在铂电极表面，更进一步的研究表示，细胞色素C可被强吸附在修饰电极表面形成一种近似的单分子层。

纳米技术的快速发展为纳米粒子在生物传感器和生物分析中的应用开拓了新的方向，由于其独特的物理、化学性质，纳米粒子引起了纳米科学家的极大兴趣，这些性质使其在化学和生物感测方面具有广阔的应用潜力。近年来，组成和空间结构不同的纳米粒子被广泛应用于不同生物分子识别的电学、光学和微量感测中。胶体金（Colloidal gold）和半导体量子点纳米粒子在生物分析中应用得非常广泛。通过与生物识别反应和纳米生物电子的耦合作用，能极大地提高这两种纳米粒子的用途。纳米粒子放大标记以及纳米粒子-生物分子的自组装产生极大的信号增强作用，为制造超灵敏的光学和电学检测奠定了基础，其灵敏度可与聚合物酶链反应（PCR）相比［7］。

纳米材料独特的性质使其在设计具有高灵敏度和选择性的核酸和蛋白质检测方法中具有广阔的应用前景。由于可以制得不同尺寸、组成和形状的纳米材料，调节其物理化学性质，使其在生物感测和生物分析中得到广泛的应用。由于纳米材料的小尺寸效应，其性质很大程度上受到与其结合的生物分子影响。近几年，不同组成的纳米粒子作为多种用途、灵敏的标记物被广泛地应用于识别不同生物分子的电子、光学和微天 帄传感器中。纳米粒子放大标记以及纳米粒子-生物分子的自组装产生极大的信号增强作用，这种技术结合了纳米粒子-生物分子自组装的放大特性和光学或电化学传感器的高灵敏性，将多个基于纳米材料的放大单元和过程结合，也能够设计出多重放大器，满足现代生物分析对更高灵敏度的需求［8］。金属纳米粒子独特的催化性质能在其本身或另一种金属纳米粒子的刺激下实现放大信号的功能。也可以通过将大量的能够产生信号的分子封装在纳米粒子中以提高每个结合过程标记物的数量，达到放大信号的目的。这些基于纳米材料的生物感测和生物分析方法还能够与其它的放大技术结合。如图1所示。

3 基于功能性纳米粒子的电化学免疫传感器与应用

基于抗体和抗原的特异性反应，免疫传感器为免疫剂的分析提供了一种灵敏的选择性的方法。在此方法中，免疫材料被固定在传感器上，通 过标记物与其中一种免疫 詴剂的复合物对分析液进行测量［9］。一般是通过测量标记物的特异活性，例如放射性、酶活性、荧光、化学发光或生物发光对分析物进行定量。但是每一种标记物都有自己的优缺点，含有金属标记物免疫检测的金属免疫检测，以克服一般的放射性标记，荧光标记和酶标记的缺点。电化学检测的金属免疫分析具有以下几种优点：如，检测液用量少、样品不用纯化、灵敏度好、仪器设备相对便宜。尽管电化学技术能够检测到nanomole有机金属化合物或金属离子，与能检测到pico-mole级的荧光检测方法相比，灵敏度还不够高。使每个结合物上含有最大量的金属标记物的理想方法是使用包含上千个金属原子的金属纳米粒子。由于其优越的氧化还原活性，胶体金是电化学免疫感测和免疫标测标记物的最佳选择。现已建立了一种基于金纳米粒子循环累积的新方法，通过阳极溶出技术检测人的免疫球蛋白（IgG）［10］。在生物素存在下，脱巯基生物素和亲合素的解离反应为能够分析最终定量的金纳米粒子的循环累积提供了有效的路线。阳极峰电流随着循环次数的增加而增大。五个循环的累积即可满足该分析方法的需要。这种方法的优点就是背景值很低，从而使人IgG的检测极限可达0.1ng/ ml。如图2、图3所示。

4 结语

纳米技术为设计超灵敏的生物传感器和生物分析方法提供了很大的机会。纳米粒子在生物传感器放大和生物分子识别具有巨大的潜力及应用价值。新的纳米粒子感测技术的超强灵敏度，为常规方法检测不到的疾病标记物提供了可行性。这种高灵敏的检测方法还能够实现疾病的早期诊断或预警。纳米粒子标记物在蛋白质检测中的应用还处于起步阶段。但超灵敏的DNA检测中的应用会为蛋白质的检测提供好的起步。

［1］张洁，吴珺 ，王传现，等.采用石墨烯修饰的电化学免疫传感器检测猪肉中的己二烯雌酚含量［J］.中国药科大学学报，2015，06∶683-685.

［2］逯岭松，刘蓓，马霄，等.电化学免疫传感器超灵敏检测髓过氧化物酶的研究［J］.重庆医学，2015，36∶109-111.

［3］任鹏飞，邵科峰，张洁，等.基于宽谱特异性抗体的β_2-激动剂多残留电化学免疫传感器的研制［J］.食品科学，2016，08∶236-238.

［4］冯德香，尉艳，黄勤安.电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用［J］.分析试验室，2016，03∶363-364.

［5］张瑶，蒙丽君，官菊芳，等.基于生物条形码信号放大的电化学方法检测hIgG［J］.江苏农业科学，2016，02∶308-311.

［6］李艳霞，陈国南.基于HRP直接标记的流感病毒H1N1电化学免疫传感器［J］.分析测试学报，2015，06∶701-702.

［7］董秀秀，王宇，沈玉栋，等.基于新型纳米材料的电化学免疫传感器及其在食品安全检测中的应用进展［J］.中国食品学报，2015，04∶136-138.

［8］刘源，吴海云，于亚平，等.快速检测水中多氯联苯含量的电化学免疫传感器设计［J］.湖北农业科学，2015，18∶93-95.

［9］Singhal P，Kuhr W G.Direct electrochemical detection of purine-and pyrimidine-based nucleotides with sinusoidal voltammetry. Analytical Biochemistry. 2013（10）∶920-921.

［10］Tsugunori Notomi，Hiroto Okayama，Harumi Masubuchi，Toshihiro Yonekawa，Keiko Watanabe，Nobuyuki Amino，Tetsu Ha.Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research . 2014（09）∶287-288.

The immune sensor is based on the close cooperation with the selective immune response and is suitable for the signal conversion technology，to monitor antigen - antibody response of biological sensors， gradually get rapid development and extensive application in many fields. In recent years the electrochemical immunosensor main research direction， in general is to improve the sensitivity， accuracy， selectivity， response time， and this article will use the single-walled carbon nanotubes as electrode， using its good conductivity， high surface area ratio， through the modification of carbon nanotubes wall and pipe end and biological molecular bonding， and keep the activity of biological molecules， the electrochemical immunosensor extremely symbolic significance. This paper combines the specific relevant theories and analysis， the application of functional nano materials in electrochemical immunosensor for research.

Functional； Nano materials； Electrochemical； Immunosensor