激光辅助孵化对高龄妇女的冻融胚胎种植潜力的影响

李正伟，许益娟，张若鹏

（1.大理大学临床医学院，云南大理671000；2.大理大学第一附属医院，云南大理671000）

激光辅助孵化对高龄妇女的冻融胚胎种植潜力的影响

李正伟1，许益娟1，张若鹏2*

（1.大理大学临床医学院，云南大理671000；2.大理大学第一附属医院，云南大理671000）

目的∶分析激光辅助孵化技术对高龄妇女冻融胚胎种植潜力的影响。方法：对427例患者，根据年龄、是否辅助孵化进行分组，比较各组间胚胎种植率及临床妊娠率。结果：＜35岁的患者，两组胚胎种植率AH组高于非AH组、差异有统计学意义，临床妊娠率无明显差异、差异无统计学意义；而≥35岁的患者，胚胎种植率及临床妊娠率AH组高于非AH组，且差异均有统计学意义。结论：激光辅助孵化技术的应用能够提升高龄患者的临床妊娠率，尤其是能显著提高冻融胚胎移植的种植率。

激光辅助孵化；高龄妇女；冻融胚胎；移植；种植率；临床妊娠率

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.015

辅助孵化（assisted hatching，AH）应用于人类辅助生殖技术已经有将近二十余年的历史，这项技术最早在1991由Jacques Cohen提出并应用，它利用物理或化学的方法对胚胎的透明带进行削薄、打孔甚至去除部分透明带，从而有利于胚胎从透明带内“破壳”而出，或使透明带溶解消失，通过对透明带的这种处理实现辅助胚胎孵化、促进胚胎植入的目的，增加胚胎着床的成功率，目前主要应用的方法有以下几种∶激光法、机械切割法及酸化法等。近年来随着显微激光医学的不断发展，激光系统因其快速、准确、安全等优越性被引入辅助孵化技术，从而形成了激光辅助孵化技术，并在临床应用中取得了显著的效果〔1〕。辅助孵化〔2〕主要适用于39岁以上或基础卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，FSH）升高（FSH＞10 U/L）者或透明带较厚（≥15 μm）或透明带颜色异常以及多次（≥3次）行体外授精-胚胎移植治疗将形态发育正常的胚胎移植但着床失败的女性不孕患者。其次，冻融胚胎的移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）或胚胎发育速度/形态异常，胚胎发育与同期对照组变慢或形态不规则等也建议应用辅助孵化〔3〕。高龄妇女的卵母细胞往往具有透明带过厚（≥15 μm）或过硬的特点，所以对于高龄妇女利用辅助孵化技术可有利于囊胚孵化，提高妊娠率。我们对生殖医学科高龄妇女体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）427个周期进行了回顾性分析，旨在分析激光辅助孵化技术对高龄妇女冻融胚胎种植潜力的影响。

1　对象与方法

1.1对象以2013年3月至2015年3月在大理大学第一附属医院生殖医学科行IVF-ET包括卵母细胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗的患者为研究对象，其中女方年龄≥35岁的129个周期。经夫妇双方均同意行激光辅助孵化后移植207个周期（激光组），其余220个周期行常规胚胎移植（常规组）。

1.2方法

1.2.1超促排方案IVF/ICSI均采用我院生殖科常规超促排方案，肌肉注射大绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）36 h后取卵。

1.2.2受精与培养以18～20 h后观察到双原核为正常受精作为判断标准，继续培养48 h后进行胚胎移植。根据观察第3天胚胎中卵裂球数目、碎片所占比例以及卵裂球的均匀程度将胚胎进行分级，只给予移植1～3级的胚胎，其中1、2级胚胎称为优质胚胎，1、2、3级胚胎称为可用胚胎。

1.2.3辅助孵化采用1.48 μm非接触式激光（SATURN3激光破膜仪，英国）对激光组进行胚胎透明带薄化。将胚胎置于40倍倒置显微镜（OLYMPUS IX70，英国）下，选择卵周隙相对较大或碎片集中区，调整激光靶心，使其位于该区透明带外缘，根据透明带厚度改变激光照射时间，从而调整透明带上的孔径大小，通常照射时间为6～16 ms，一般不超过20 ms，每个胚胎连续照射不超过10次，否则易造成胚胎受损，从而影响胚胎着床，我科采用在胚胎的3个面激光削薄，最终在透明带上形成一个长约80 μm（约相当于透明带总长度的1/4左右），深度为透明带总厚度的50%～80%的薄化区，将辅助孵化后的胚胎放入培养箱内继续培养至移植。

1.2.4内膜准备自然周期∶根据阴道超声（Tran svaginal ultrasound，TVS）检测，优势卵泡直径≥14 mm而≤18 mm，子宫内膜厚度达到7～8 mm以上，排卵即黄体生成素（Luteinizing Hormore，LH）峰（当血LH＞20 U/L时可认为出现血LH峰）后第2～3天为解冻日。激素替代周期∶分为递增方案及恒定剂量方案，月经第3～5天开始用戊酸雌二醇片（补佳乐，国产），内膜厚度达到8 mm或以上，用3 d地屈孕酮后，于第4～5天进行胚胎移植。

1.2.5胚胎移植与妊娠结果判断移植后14 d进行血或尿HCG或β-亚基-人线毛膜促性腺激素（β-Human Chorionic Gonadotropin，β-HCG）测定，如为阳性，移植后30～35 d行超声检查示子宫腔内见妊娠囊及原始心管搏动即可确定为胚胎种植成功，即临床妊娠。

1.2.6统计学方法本研究采用SPSS17.0软件进行χ2检验，设定P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1激光组胚胎种植率与临床妊娠率激光组中移植207个周期，临床妊娠61例，妊娠率为29.46%，其中双胎17例。共移植胚胎394个，胚胎种植117个，胚胎种植率为29.70%。

2.2常规组胚胎种植率与临床妊娠率常规组中移植220个周期，临床妊娠54例，妊娠率为24.55%，其中双胎13例。共移植胚胎424个，胚胎种植74个，胚胎种植率为17.45%。

2.3高龄妇女与非高龄妇女中辅助孵化组与非辅助孵化组间妊娠率的比较在＜35岁妇女中，比较AH组与非AH组临床妊娠率，其中AH组临床妊娠率为27.97%，略高于对照组27.74%（P＞0.05），差异无统计学意义。在≥35岁妇女中，AH组临床妊娠率为32.81%，明显高于对照组16.92%（P＜0.05），差异有统计学意义。激光辅助孵化能够有效提升高龄患者的临床妊娠率。见表1。

表1　高龄妇女与非高龄妇女中辅助孵化组与非辅助孵化组间妊娠率的比较

2.4高龄妇女与非高龄妇女中辅助孵化组与非辅助孵化组间种植率的比较在＜35岁妇女中，比较AH组与非AH组胚胎种植率，其中AH组胚胎种植率为25.14%，明显高于对照组19.68%（P＜0.05），差异有统计学意义。在≥35岁妇女中，AH组临床妊娠率为17.65%，明显高于对照组6.91%（P＜0.05），差异有统计学意义。激光辅助孵化均能提高两组人群的胚胎种植率，其中对高龄组人群提高胚胎种植率更显著。见表2。

表2　高龄妇女与非高龄妇女中辅助孵化组与非辅助孵化组间胚胎种植率的比较

2.5高龄妇女与非高龄妇女中辅助孵化组与非辅助孵化组间流产率的比较在＜35岁妇女中，比较AH组与非AH组临床妊娠率，其中AH组临床流产率为70.63%，略高于对照组67.74%（P＞0.05），差异无统计学意义。在≥35岁妇女中，AH组临床妊娠率为67.19%，略高于对照组64.62%（P＞0.05），差异无统计学意义。激光辅助孵化技术对胚胎的损伤并不影响临床流产率。见表3。

表3　高龄妇女与非高龄妇女中辅助孵化组与非辅助孵化组间胚胎种植率的比较

3　讨论

随着现代科技的不断发展与进步，人类辅助生殖技术得到了创新性的发展，为那些不孕不育患者带来了更多的生育机会，是广大因各种原因而不能生育的夫妇的福音。但是，目前胚胎移植后的种植率仍较低，这是我们辅助生殖领域一个需要解决且很棘手的重要问题。大量研究表明，在行胚胎移植前用胚胎移植管轻微搔刮子宫内膜，可以有效提高妊娠率〔4〕。有些研究者质疑辅助孵化的安全性，而Zhou H等〔5〕的研究通过比较产科及新生儿科AH组与非AH组的产科结局、新生儿的结果和先天性出生缺陷的记录证实了辅助孵化技术的安全性。透明带对温度的适应度较差，当透明带暴露于极低的温度后，透明带会发生冻结反应，导致透明带变硬，从而导致胚胎孵化困难，目前多项研究认为这是造成胚胎移植后种植率较低的主要原因。卵细胞的外层具有外被，其主要成分为糖蛋白，在哺乳动物中该外被称为透明带，而人类胚胎透明带有内外两层，其中内层富有弹性，却难以薄化和扩张，这是造成胚胎不易成功孵化的主要原因〔6〕。大量的研究表明，对透明带削薄的最适宜范围是∶深度达胚胎透明带的致密层，即相当于透明带厚度的50%～80%，宽度则相当于透明带总长的1/4〔7〕。本次研究中使用的激光照射也采用了以上提到的薄化范围，且为了更好地避免激光带来的热效应和突变效应，我院采用三边法照射，并不局限于采用连续照射，且我院采用的激光能量也是参考了Schimmel T等的研究〔8〕，我们利用激光处理透明带时选择卵周隙相对较大或碎片相对集中区进行薄化，经观察研究，该方法能有效减少激光照射透明带时对胚胎造成的损伤，故两个年龄组的流产率差异无统计学意义。见表3。

目前，对于不同辅助孵化对胚胎种植潜力的影响仍存在争议，Balaban等〔9〕对透明带切割法（PZD）、酸化法、酶化法和激光法4种辅助孵化方法对临床妊娠率及胚胎种植率的影响进行了对比性研究，结果发现4种方法对胚胎种植潜力的影响几乎相似，而其中各种方法的利弊又决定了激光辅助孵化法是目前应用最为广泛的。敖磊等〔10〕的研究中认为，激光辅助孵化法中，薄化与打孔两种透明带处理方式在冻融胚胎移植中的临床妊娠率及胚胎种植率相近，而激光薄化法能有效减少激光处理透明带时所带来的热效应对胚胎造成的损伤，所以认为激光削薄比激光打孔更适用于临床应用，现在也逐步被广泛应用。而Wan CY等〔11〕的研究中通过比较激光辅助孵化组与对照组的移植率与临床妊娠率及活产率，初步评估了激光辅助孵化对胚胎移植的影响。而在我们的研究中，除了与年龄相关的影响因素，两组患者其他各影响因素之间均无明显差异，例如胚胎质量的筛选、进行胚胎移植的时机及进行胚胎移植的内膜准备等因素。从本次研究得出数据可知，在非高龄产妇群体中采用激光辅助孵化组与常规组的临床妊娠率无统计学差异，而在高龄产妇中，采用激光辅助孵化与常规组的临床妊娠率差异有统计学意义（P＜0.05），且激光组的胚胎种植率要显著高于常规组，差异有统计学意义（P＜0.05）。通过对比高龄妇女组中AH组与非AH组间的种植率和妊娠率，可得出高龄妇女中AH组的种植率及妊娠率均显著高于非AH组（P＜0.05）。故认为激光辅助孵化技术能显著提高胚胎种植率，提升冻融胚胎的种植潜力。这与张琪瑶等〔12〕及Lee YS等〔13〕的研究结果相似。

综上所述，激光辅助孵化技术的应用能够提升高龄患者的临床妊娠率，尤其是能显著提高冻融胚胎移植的种植率。

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Influence of Laser-assisted Hatching on the Potential of Elderly Women's Frozen-thawed Embryo Implantation

Li Zhengwei1，Xu Yijuan1，Zhang Ruopeng2*
（1.Clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.The First Affiliated Hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To analyze the influence of laser-assisted hatching technology on the potential of elderly women's freezethawed embryo transfer.Methods:427 patients were grouped by age and assisted hatching（AH）.Comparison of embryos implantation rate and clinical pregnancy rate were carried out among groups.Results:Among＜35 years old patients，two groups'embryos implantation rate of AH were higher than non-AH groups with statistically significant，but there was no difference in clinical pregnancy rate and statistic；among≥35 years old patients，embryo implantation rate and clinical pregnancy rate of AH group were higher than non-AH group，and were statically significant.Conclusion:The application of laser-assisted hatching technology can increase clinical pregnancy rate in elderly patients，especially in greatly promoting implantation rate of frozen-thawed embryo.

laser-assisted hatching；elderly women；frozen-thawed embryo；transplant；implantation rate；clinical pregnancy rate

R321.1

B

2096-2266（2016）10-0057-04

（责任编辑董杰）

云南省教育厅科学研究基金资助项目（2013C172）

2015-08-18

2016-04-29

李正伟，硕士研究生，主要从事妇产科学生殖医学研究.

*通信作者：张若鹏，副主任医师.