大理白族老年人2型糖尿病与线粒体ND1基因T3394C突变的相关性

杨勇琴，杨泽芳，陈亚丽，欧阳文军，杨佳妮，张晓娟，熊　伟*

（1.大理大学基础医学院，云南大理671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000；3.大理大学大理教学医院呼吸内科，云南大理671000）

大理白族老年人2型糖尿病与线粒体ND1基因T3394C突变的相关性

杨勇琴1，2，杨泽芳1，陈亚丽1，欧阳文军1，杨佳妮1，张晓娟3，熊伟1，2*

（1.大理大学基础医学院，云南大理671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000；3.大理大学大理教学医院呼吸内科，云南大理671000）

目的：研究人线粒体呼吸链烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶第一亚单位（ND1）基因3394位点T→C突变与我国云南大理白族老年人2型糖尿病的相关性。方法：随机抽取无血缘关系的云南大理白族200例老年2型糖尿病患者（糖尿病组）及218例无糖尿病家族史、糖耐量正常的老年人群（正常对照组），用聚合酶链反应扩增、限制性内切酶HaeⅢ消化进行点突变筛查。结果：糖尿病组中5例患者存在线粒体DNA ND1基因3394位点T→C突变（2.50%），正常对照组中仅有1例出现该位点突变（0.46%），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。线粒体ND1基因3394位点T→C基因突变的糖尿病患者具有明显的母系遗传特征。结论：线粒体ND1基因3394位点T→C突变与云南省大理白族老年人2型糖尿病患者发病相关。

线粒体ND1基因；2型糖尿病；T3394C突变；白族

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.008

人线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）为16 569 bp的环状双链DNA分子，共编码37个基因，包括13个呼吸链复合体亚单位的基因、2个rRNA基因（12S rRNA和16S rRNA）和22个tRNA基因，具有母系遗传的特征。tRNALeu（UUR）基因为线粒体糖尿病的“突变热点”，尤其以A3243G位点突变最为多见，1997年美国糖尿病协会已将这类糖尿病分型为胰岛β细胞功能遗传缺陷性糖尿病〔1〕。

线粒体被称为细胞的“动力工厂”，是细胞内通过氧化磷酸化合成ATP的主要场所。编码线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶第一亚基（ND1）的基因突变可能导致线粒体呼吸链复合体I酶活性降低，细胞内ATP合成减少，进而影响胰岛β细胞合成和分泌胰岛素，促进糖尿病的发生〔2〕。2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是临床最常见的糖尿病类型，门诊的糖尿病人中，90%以上都属于2型糖尿病，多发于肥胖的中老年人。国内外研究表明，不同种族和不同地区的人群中，线粒体基因组许多不同位点的基因点突变均可能与老年人2型糖尿病的发生有关〔3-6〕。目前，线粒体DNA的ND1基因T3394C点突变是否与我国白族老年人群2型糖尿病的发生相关尚无报道。基因多态性有显著的种族差异，在环境-基因相互作用模式上，不同的种族之间有可能有较大差异。因此，本研究利用大理地区特有的资源优势，开展云南大理地区白族老年人群2型糖尿病的发生与线粒体ND1基因T3394C点突变相关性的研究工作，现报道如下。

1　材料与方法

1.1研究对象选取2014年1月至2015年9月在大理市第一人民医院和云南省第四人民医院就诊的200例大理本地白族老年糖尿病患者作为糖尿病组，男83例，女117例。年龄60～81岁，平均年龄（66.7±8.4）岁。对照组选取218例，男102例，女116例，年龄60～85岁，平均年龄（67.4±7.9）岁，糖耐量正常且无糖尿病家族史，无急性心脑血管疾病、急性应激状况及内分泌系统疾病。两组患者性别、年龄及体重指数差异无统计学意义，具有可比性。以上研究个体之间无血缘关系，追溯3代均为同一民族个体，且在云南大理地区居住3代以上。所有的检查以及标本的收集手续和过程均按照赫尔辛基宣言要求的原则进行，并获大理大学医学伦理委员会批准，严格按照其规定的程序进行，同时得到患者的知情同意〔7〕。常规抽取外周静脉血，进行基因组DNA提取。

1.2仪器及试剂

1.2.1仪器2720 Thermal Cycler型号PCR扩增仪（美国Applied Biosystems公司）；凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；全自动灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DYCZ-24D蛋白电泳槽（北京六一仪器厂）；HH-4恒温水浴锅（上海国华电器有限公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2.2试剂哺乳动物全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物科技公司）；限制性核酸内切酶HaeⅢ（美国NEB公司）；Taq DNA聚合酶（大连Takara公司）；DNA Marker（90602C）（四川绵阳天恩泽基因工程有限公司）；DuRed核酸染料（北京全式金公司）；琼脂糖（Biowest Agarose）为西班牙进口分装；乙醇、异丙醇等化学试剂均为国产分析纯。

1.3方法

1.3.1引物设计及合成引物设计参照人mtDNA剑桥序列（GenBank∶J01415），由昆明硕擎生物技术有限公司合成（PAGE级纯化，纯度99%）。上游引物（Forword）序列为5'-GGATCAGGACATCCCGAT-3'，下游引物（Reverse）序列为5'-GGTTTTAGGGG CTCTTTGG-3'。

1.3.2基因组DNA提取取外周静脉血2 mL，加入0.2 mL EDTA-K2抗凝。采用哺乳动物全血基因组DNA提取试剂盒，按照说明书提取外周血总DNA，NanoDrop核酸蛋白分析仪测定DNA浓度和纯度。

1.3.3聚合酶链反应扩增-限制性酶切片段多态性分析（PCR-RFLP）PCR反应体系为∶DNA模板（50 ng/μL）1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，上游引物和下游引物各1 μL，加双蒸水补充至总体积25 μL。PCR反应条件为∶95℃预变性5 min后进入循环，每个循环为95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，共循环35次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR反应产物10 μL加至2 μL的6×loading buffer中混匀，加样于1.5%琼脂糖凝胶，恒压120 V，于1×TAE缓冲液中电泳30 min，凝胶成像系统观察有无PCR产物。HaeⅢ限制性内切酶于37℃恒温水浴中酶切PCR产物30 min，15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳酶切产物，DuRed核酸染料染色，凝胶成像系统显影观察。

1.3.4DNA测序将5例疑似突变阳性的T2DM组标本及8例无突变的正常对照组标本的PCR产物送昆明硕擎生物技术有限公司进行DNA纯化和测序。

1.3.5T2DM组患者临床资料收集记录T2DM组和正常对照组个体的性别、年龄、起病年龄、家族史、体重指数（BMI）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（P2BG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、血清C肽（F-C peptide）及治疗方法（饮食、口服降糖药或胰岛素治疗）〔8〕。

2　结果

2.1线粒体DNA片段的PCR扩增利用合成的引物分别对T2DM组和正常对照组样本的基因组DNA进行PCR扩增，预期目的片段大小为266 bp，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增效果良好，与预期片段大小相符，没有非特异性条带的出现。见图1。

图1　mtDNA ND1基因片段的PCR扩增结果

2.2PCR-RFLP检测线粒体tRNALeu（UUR）基因T3394C突变∶通过PCR-RFLP分析（HaeⅢ/3394），野生型经HaeⅢ内切酶水解，可以得到169、97 bp两个酶切片段，当3394发生T→C突变后（酪氨酸→组氨酸），新增的酶切位点将97 bp切割为80、17 bp两个片段，因此T3394C突变个体最终可得到169、80、17三个片段。配制15%的聚丙烯酰胺凝胶，120 V稳压电泳约2 h，电泳结束后核酸染料染色，于凝胶成像系统拍照，实验结果表明∶200例T2DM组患者中共检出5例T3394C突变，其中3例为线粒体DNA异质性突变，2例为线粒体DNA同质性突变。218例正常对照组中有1例T3394C突变，为线粒体DNA异质性突变。见图2。

图2　非变性PAGE电泳检测线粒体ND1基因T3394C突变

2.3线粒体DNA T3394C突变分析在200例T2DM组患者中共检出5例T3394C突变，突变率为2.50%，218例正常对照组中有1例突变，突变率为0.46%，T3394C突变率在两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4突变与家族史的关系两组人群中可见明显的DM家族史（χ2=1.041，P＜0.05）和母系遗传倾向（χ2=3.840，P＜0.01）。见表1。

表1　线粒体ND1基因突变与糖尿病家族史的关系

2.5糖尿病组患者临床资料比较T2DM组患者分为T3394C突变阳性组和T3394C突变阴性组，两组之间在性别、年龄、BMI、FBG、P2BG、HbA1c、血清C肽及治疗方法方面差异无统计学意义（P＞0.05），但两组之间的起病年龄差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

2.6DNA测序结果将T2DM组5例疑似突变阳性标本及正常对照组8例无突变标本的PCR产物进行纯化后直接正向测序，对有T3394C突变的标本再次进行反向测序验证，证明所有T2DM组样本的T3394C突变结果可靠。见图3。

图3　PCR产物直接测序结果

3　讨论

线粒体DNA直接暴露在氧化磷酸化过程所产生的自由基中，同时组蛋白保护的缺乏，DNA修复酶的相对不足，因此线粒体DNA比核DNA更容易受到损伤，突变率比核DNA高10～20倍，在老年人群中突变率尤为高〔9〕。60岁以上的人群中糖尿病的患病率超过10%，糖尿病总人群的50%以上为老年糖尿病患者〔10〕。线粒体ND1基因T3394C突变是一种错义突变，可引起线粒体呼吸链ND1亚单位中的一个中性的酪氨酸被亲水性的组氨酸取代。该突变可改变ND1空间构型，使NADH脱氢酶活性下降，ATP合成减少，导致胰岛β细胞能量供应不足，从而影响胰岛素分泌，参与2型糖尿病的发生〔11〕。

1996年，HIRAI等首次报道日本2型糖尿病患者群存在mtDNA T3394C突变，其突变率为4.90%，正常人群为1.30%〔12〕。国内外不同的研究表明，线粒体ND1基因T3394C突变在T2DM人群中发生率为3.00%～6.00%，在正常对照组人群发生率为0.00%～2.06%〔13-15〕。本研究结果显示大理白族老年人2型糖尿病组中线粒体ND1基因T3394C突变率为2.50%，正常对照组中基因突变率仅为0.46%，组间差异有统计学意义，从而认为线粒体ND1基因3394T→C突变与大理白族老年2型糖尿病的发病相关。进一步分析老年2型糖尿病ND1基因T3394C突变患者的临床资料，发现该位点突变并没有影响到糖尿病患者的BMI、FBG、P2BG、HbA1c、血清C肽的变化及治疗方法等方面。但是，线粒体ND1基因T3394C突变阳性组糖尿病患者的起病年龄比突变阴性组患者更低，两组差异极显著，且突变阳性患者的母系遗传特征明显。

目前对于云南大理白族人群线粒体遗传结构与其他地区民族的差异及其与相关疾病关系的研究还不是特别清楚，本实验初步明确了线粒体ND1基因T3394C突变与这一群体中老年2型糖尿病患者之间的相关性，对大理白族老年人2型糖尿病的治疗指导和病情预测具有一定的指导意义。本研究表明，线粒体ND1基因T3394C点突变可能是云南大理老年白族人群2型糖尿病的致病因素，在多因素的共同作用下，诱导糖尿病的发生，且具有母系遗传的特点。

综上所述，老年人2型糖尿病的病因复杂，国内外不同民族由于遗传背景和生活方式等多方面的不同，导致线粒体DNA突变率存在较大差异，需要更多样本的深入研究来进一步证实，为老年人2型糖尿病患者提供风险预报〔16〕。本研究对大理白族地区老年人2型糖尿病早发现、早治疗、减少糖尿病并发症的发生具有一定的临床意义。

表2　T2DM患者线粒体ND1基因突变（+）和突变（-）组间临床资料比较

〔1〕王鉴，顾鸣敏.线粒体基因突变与糖尿病的相关性研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2012，12（24）：4752-4756.

〔2〕汤冬玲，李栋，文重远.线粒体DNA变异与老年2型糖尿病患者易感性的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2012，12（32）：448-451.

〔3〕徐金瑞，周晶，杨易，等.宁夏地区回族人群2型糖尿病与线粒体基因突变的相关性分析〔J〕.实用医学杂志，2009，25（23）：3546-3548.

〔4〕石柔，雷又鸣，宋滇平，等.云南地区2型糖尿病患者线粒体tRNALeu（UUR）3243A/G突变的筛查〔J〕.昆明医科大学学报，2014，35（3）：44-46.

〔5〕谭凤明，程喜平，陈盛强，等.不同年龄Ⅱ型糖尿病患者中黑白头发mtDNA异质性研究〔J〕.南方医科大学学报，2012，32（1）：85-88.

〔6〕黄承乐，黄红华，丁凯宏.线粒体DNA ND1基因T3394C点突变与2型糖尿病的关系〔J〕.检验医学，2011，26（2）：122-124.

〔7〕钱杰，张丽容.线粒体DNA ND1基因点突变与2型糖尿病的关系〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2003，19（1）：46-47.

〔8〕赵青，张丽容.线粒体DNA的ND1基因3394T→C与糖尿病的关系〔J〕.中华医学遗传学杂志，2001，18（3）：229-230.

〔9〕于佩，于德民，刘德敏.天津地区汉族人线粒体ND1基因突变与2型糖尿病的关系〔J〕.天津医药，2003，31（8）：497-499.

〔10〕康庄，苏恒，张云，等.大理白族2型糖尿病与脂联素基因多态性相关性分析〔J〕.检验医学与临床，2013，11（23）：3122-3124.

〔11〕陈静，万钢，冯结，等.2型糖尿病相关线粒体ND1基因的荟萃分析〔J〕.中国心血管杂志，2009，14（4）：304-306.

〔12〕HIRAI M，SUZUKI S，ONODA M，et al.Mitochondrial DNA 3394 mutation in the NADH dehydrogenase subunit 1 associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1996，219（3）：951-955.

〔13〕李瑞凯，陈洁，吴利平，等.线粒体与2型糖尿病〔J〕.中华临床医师杂志，2013，7（18）：8400-8401.

〔14〕DURAISAMY P，ELANGO S，VISHWANANDHA V P，et al.Prevalence of mitochondrial tRNA gene mutation and their association with specific clinical phenotypes in patients with type 2 diabetes mellitus of Coimbatore〔J〕. Genet Test Mol Biomarkers，2010，14（1）：49-55.

〔15〕修玲玲，梁伟，吴华，等.线粒体基因ND1/T3394C突变与糖尿病〔J〕.中山医科大学学报，2002，23（2）：111-113.

〔16〕许敬平，吴大为，邵俊涛，等.线粒体DNA的ND1基因G3316A、T3394C与老年2型糖尿病的相关性〔J〕.山西医科大学学报，2013，44（7）：515-517.

The Correlation between Point Mutation of T3394C in Mitochondrial ND1 Gene and Patients with Type 2 Diabetes Mellitus in Aged Bai Minorities in Dali

Yang Yongqin1，2，Yang Zefang1，Chen Yali1，Ouyang Wenjun1，Yang Jiani1，Zhang Xiaojuan3，Xiong Wei1，2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China；3.Respiratory Department，Dali Teaching hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To investigate the correlation between point mutation of T3394C in mitochondrial NADH ND1 gene and patients with type 2 diabetes mellitus in aged Bai minorities in Dali.Methods:200 unrelated individuals with type 2 diabetes mellitus（T2DM group）which were randomly chosen among aged Bai minorities in Dali，Yunnan，and 218 aged cases with normal glucose tolerance without DM family history（Control group）were inspected.Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）technology were used for screening.Results:The point mutation T3394C in mitochondrial ND1 gene were found in 5 cases in T2DM group（2.50%），while only 1 case in control group（0.46%），and there were significant differences between two groups（P＜0.05）.Mitochondrial ND1 gene T3394C point mutation in patients with type 2 diabetes mellitus showed obvious maternal inheritance characteristics.Conclusions:The point mutation of T3394C in the mitochondrial DNA ND1 gene may be related to the occurrence of T2DM in aged Bai minorities in Dali.

mitochondrial ND1 gene；type 2 diabetes mellitus；T3394C mutation；Bai minority

R587.1

A

2096-2266（2016）10-0030-05

（责任编辑李杨）

国家自然科学基金资助项目（81560458）；云南省教育厅科学研究基金资助项目（2014Z126）；大理大学基础医学院大学生科研基金资助项目（201502）；云南省大学生创新创业计划资助项目（201408）；大理大学博士科研启动基金资助项目（BSKY2012018）

2015-12-09

2016-02-29

杨勇琴，讲师，主要从事基础医学研究.

*通信作者：熊伟，副教授，博士.