2014年北京市西城区40例麻疹患者分离的麻疹病毒基因型及同源性

张晶波，王敬辉，崔京辉，于霞丽,陈 萌

(1 北京市西城区疾病预防控制中心,北京 100120； 2 北京市疾病预防控制中心,北京 100013)



·论著·

2014年北京市西城区40例麻疹患者分离的麻疹病毒基因型及同源性

张晶波1，王敬辉1，崔京辉1，于霞丽2,陈 萌2

(1 北京市西城区疾病预防控制中心,北京 100120； 2 北京市疾病预防控制中心,北京 100013)

目的 了解北京市某城区2014年分离的麻疹病毒基因型，及时发现输入性麻疹病例。方法 采用荧光聚合酶链反应(PCR)方法，对北京市西城区2014年采集的标本进行病毒核酸鉴定、RT-PCR扩增，扩增产物进行测序及序列比对分析。结果 2014年北京市西城区共采集81例麻疹疑似患者的82份标本，其中咽拭子63份，尿19份。麻疹病毒核酸检测阳性70例，RT-PCR扩增、测序获得基因序列40份，麻疹病毒培养阳性毒株37例。种系进化树分析显示，获得的40份麻疹病毒基因序列与H基因簇代表株Chin9322/H1a，以及世界卫生组织推荐的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1在同一分支上，核苷酸水平上同源性分别为98%～98.9%、96.9%～97.8%；氨基酸水平上同源性分别为97.3%～99.3%、95.3%～98%。结论 2014年北京市西城区麻疹病例以本土基因型(H1)病例为主，进一步加强麻疹病例病原学监测对麻疹输入性病例的控制和预防具有重要意义。

麻疹病毒； 核酸检测； H1基因型； 流行病学

[Chin J Infect Control，2016，15(10)：780-784]

麻疹是由麻疹病毒感染引起的一种急性传染病，以发热、出疹和呼吸道卡他症状为主要临床表现。麻疹病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属，只有一个血清型。病毒基因组由6个结构基因和2个非结构基因组成，分别编码6个结构蛋白和2个非结构蛋白。麻疹病毒N基因羧基末端450个核苷酸基因是最大变异区，世界卫生组织(WHO)将其序列作为划分病毒基因型别的依据。根据WHO的建议，麻疹病毒被划分为A～H共八个基因组23个基因型，其中B1、D1、E、F、G1基因型已消失，目前只有18个基因型在世界各地人群中流行。北京市西城区于2013年3月发现了首例输入性麻疹病毒D8基因型病例，之后在其他区相继出现多起该基因型引起的麻疹疫情。开展麻疹病毒分子生物学监测,明确麻疹野病毒的型别与来源,及时发现输入性病例对麻疹的控制及消除具有重要的意义[1-3]。为进一步了解北京市西城区麻疹病毒基因特征，我们对2014年麻疹监测结果进行了分析。

1 材料与方法

1.1 标本 咽拭子或尿，由北京市西城区疾病预防控制中心计划免疫科、辖区保健科及辖区医院采集提供，2014年共计采集疫情及监测患者81例82份标本，其中咽拭子63份，尿19份。

1.2 标本的分装处理 实验室收到标本4°C保存或-70°C以下保存，标本送至实验室后立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。72 h内完成标本定量聚合酶链反应(PCR)核酸鉴定,麻疹阳性标本做RT-PCR麻疹病毒基因片段扩增。

1.3 实验室检测

1.3.1 核酸提取 采用美国ABI公司核酸提取试剂盒MagMaxTM-96 Viral Isolation Kit提取核酸。

1.3.2 基因分型引物 引物序列使用美国疾病控制与预防中心(CDC)麻疹基因定型引物扩增N基因COOH末端的634个核苷酸片段,引物序列为:上游引物MeV216(5′-TGG AGCTATGCCATGGGAGT-3′)，下游引物MeV214(5′-TAACAATGATGGAGGGTAGG-3′)。

1.3.3 仪器 CLASSⅡ生物安全柜为新加坡ESCO公司生产，低温离心机为SIGEMA 3K15(SIGEMA公司出品)，全自动核酸提取仪MagMaxTMExpress及定量PCR仪7500 Fast Real-time PCR System(ABI公司出品)，PCR扩增仪iCycler伯乐公司出品。

1.3.4 核酸检测试剂盒 麻疹风疹双通道real-time PCR试剂盒由江苏和创公司生产，麻疹基因片段扩增采用InvitrogenTMOne-Step RT-PCR Kit(美国Invitrogen公司生产)。具体操作、反应条件和结果判定见试剂盒说明书。

1.4 麻疹病毒基因片段扩增方法 采用一步法RT-PCR, 扩增麻疹N基因片断。反应参数:逆转录阶段：42 °C，10 min；预变性阶段：94 °C，10 s；预扩增阶段：变性 94 °C，5 s；退火50 °C，20 s；延伸72 °C，20 s；共5个循环：变性 94°C，5 s；退火56 °C，50 s；延伸72 °C，15 s；共40个循环。PCR完成后, 用1.7%琼脂糖凝胶电泳分析结果, 扩增片段为634 bp。PCR产物送至北京市疾病预防控制中心,统一送测序公司进行序列测定,然后由北京市疾病预防控制中心反馈结果。

1.5 序列分析 摘录GenBank中收录的WHO推荐的麻疹病毒代表株、中国疫苗株及H基因簇代表株的序列，进行核苷酸和氨基酸的相似性和差异比对，构建系统发育树。麻疹病毒基因变化最大的区域是N基因羧基端的450个核苷酸，选取450 bp进行序列分析，应用BioEdit 6.0及Mega 6软件进行系统发育树的构建。

2 结果

2.1 麻疹病毒核酸检测结果及病例相关情况 2014年共采集麻疹疑似患者81例的82份标本，麻疹病毒核酸检测阳性70例,RT-PCR扩增、测序获得基因序列40份，麻疹病毒培养阳性毒株37例。获得麻疹病毒基因序列的40例患者主要集中在3～5月，以成人(19～55岁)居多，共23例(57.5%)，<1岁患儿(4个月～1岁)共15例(37.5%)。仅2例有疫苗接种史，其余均为不详或无；女性22例，男性18例；均为本市病例。其中11例患者采集了血标本，9例为麻疹血IgM抗体检测阳性。见表1。

2.2 麻疹病毒基因型进化树分析 对40份麻疹病毒基因序列进行分析，与WHO推荐的代表株、中国疫苗株及H基因簇代表株核酸种系进行比对，种系进化树显示,本研究40份序列与H基因簇代表株Chin9322/H1a和WHO推荐的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1在同一分支上。根据WHO对麻疹病毒基因型别划分的规定，西城区获得的麻疹病毒基因序列均为H1基因型，进一步分型为H1a基因型。见图1。

表1 2014年北京市西城区40例获得基因序列的麻疹患者基本情况

图1 2014年北京市西城区40份麻疹病毒基因序列进化树分析

2.3 核苷酸和氨基酸变异情况 将40份麻疹病毒基因序列与Chin9322/H1a，以及WHO推荐的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1的核苷酸和氨基酸同源性进行对比分析，核苷酸水平上同源性分别为98%～98.9%和96.9%～97.8%；氨基酸水平上同源性分别为97.3%～99.3%和95.3%～98%。见表2。

表2 2014年北京市西城区40例麻疹病毒基因序列与参考株序列的核苷酸和氨基酸同源性比对

Table 2 Comparison of nucleotide and amino acid homology between 40 cases of measles virus gene sequences and reference strain sequences, Beijingin Xicheng District, 2014

序号样本标号核苷酸Chin9322/H1aHunan.CHN/0.93/7/H1氨基酸Chin9322/H1aHunan.CHN/0.93/7/H11Beijing14-002-XCM398.497.397.3962Beijing14-005-XCM49896.99896.73Beijing14-021-XCM698.497.396.795.34Beijing14-135-XCM1598.797.699.3985Beijing14-136-XCM1698.797.699.3986Beijing14-137-XCM1798.797.697.3967Beijing14-138-XCM1898.797.697.3968Beijing14-148-XCM2198.797.699.3989Beijing14-149-XCM2398.797.699.39810Beijing14-150-XCM2498.497.397.39611Beijing14-151-XCM2598.497.397.39612Beijing14-213-XCM2798.797.697.39613Beijing14-214-XCM2898.497.398.797.314Beijing14-231-XCM2998.797.699.39815Beijing14-232-XCM3098.997.899.39816Beijing14-233-XCM3198.797.697.39617Beijing14-289-XCM2298.997.899.39818Beijing14-291-XCM3898.797.699.39819Beijing14-292-XCM3298.797.697.39620Beijing14-293-XCM3398.797.699.39821Beijing14-294-XCM3598.997.899.39822Beijing14-507-XCM4698.497.397.39623Beijing14-508-XCM4898.997.899.39824Beijing14-572-XCM5098.997.899.39825Beijing14-573-XCM5198.797.699.39826Beijing14-574-XCM5298.997.899.39827Beijing14-575-XCM5398.797.699.39828Beijing14-576-XCM5498.497.397.39629Beijing14-577-XCM5598.497.397.39630Beijing14-578-XCM5698.997.899.39831Beijing14-630-XCM4098.997.899.39832Beijing14-825-XCM6398.297.196.795.333Beijing14-935-XCM298.797.699.39834Beijing14-936-XCM7198.797.699.39835Beijing14-937-XCM7298.797.699.39836Beijing14-938-XCM7398.797.699.39837Beijing14-1044-XCM7598.997.899.39838Beijing14-1047-XCM7798.497.399.39839Beijing14-1234-XCM7898.997.899.39840Beijing14-1239-XCM8198.797.699.398

3 讨论

麻疹是一种全球广泛传播的病毒性传染病，是导致儿童死亡最多而疫苗可以预防的疾病，也是WHO拟消除的疾病之一。2006年我国卫生部发布了《2006—2012年全国消除麻疹行动计划》，我国麻疹发病率大幅下降，2010年又进行了全国强化免疫，从2010年的2.86/10万下降至2012年的0.46/10万，达到有记录以来的最低水平。但是2013年又出现了反弹，分离的麻疹病毒达到历史最高水平，输入性麻疹病毒基因型有所增加。目前，世界上有18个麻疹病毒基因型流行，中国流行的麻疹病毒本土基因型为H1基因型，2009年开始陆续出现输入性病例，先后监测到D9、D4、D11等基因型[2,4-8]。1993—2013年中国麻疹实验室网络病毒学监测结果显示，5 163株麻疹病毒，5 013株为H1a型，其他基因型按照数量依次为D9、D8、A、D11、B3、H2和D4，说明我国麻疹病毒基因型以H1a型为本土优势基因型，其他基因型散在存在[8]。北京市1999—2008年麻疹监测结果显示，除1例D9基因型外，其余麻疹病毒均为H1基因型，说明北京市流行的麻疹病毒基因型与全国一致。2013年北京市加强了麻疹病例病原学监测，发现了输入性D8、D9基因型麻疹病毒病例，除5例为D8基因型外，西城区其他麻疹病例均为H1基因型[3，9-12]。

为进一步监测西城区麻疹病例的病毒基因型，我们对2014年北京市西城区获得的40份麻疹病毒基因片段进行序列分析，结果显示均为H1基因型H1a基因亚型，与北京市、江苏省、辽宁及全国的优势本土毒株基因型一致[8，10,13-14]。40份麻疹病毒基因序列与Chin9322/H1a，以及WHO推荐的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1的核苷酸和氨基酸同源性进行对比分析，发现在核苷酸水平上其同源性分别为98%～98.9%、96.9%～97.8%，在氨基酸水平上其同源性分别为97.3%～99.3%和95.3%～98%，说明西城区流行的麻疹病毒相对保守，变异不大。40例获得基因序列的麻疹患者均为本市病例，以成人居多，一岁以下儿童次之，与北京市麻疹流行病学特征一致[15]。儿童是麻疹的易感人群，但疫苗接种初次为8个月，因此，小月龄儿童发病率高与未接种疫苗和疫苗接种时间有关；成人发病率高也与疫苗接种有关，免疫空白使得成人成为麻疹的易感人群。

由于北京市西城区监测范围小，病例少，数据有限，不具有北京市的代表性，但本辖区监测数据及时有效，2013年西城区发现了北京市首例输入性麻疹病毒D8基因型病例，对北京市的监测系统具有预警作用[3]。我国已进入加速消除麻疹阶段，对麻疹的实验室监测提出了新要求，加强麻疹病例病毒基因型监测，不仅可以发现输入性病例，也可提高该病病毒本土基因型的检出率。通过分子流行病学溯源，严密监测麻疹发病和病毒基因型特征变化，及时发现麻疹病毒的流行趋势，发现输入性病例，可以有效控制麻疹疫情蔓延，为消除麻疹提供病毒基因水平的证据。疫苗接种是消除麻疹的关键，成人的免疫空白导致成人发病率高，此部分人群逐年累积,很容易引起麻疹暴发，提示有效地控制成年人麻疹病例的发生,在人口较集中的区域进行针对性麻疹疫苗的免疫接种，对麻疹防控具有重要的指导意义。

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(本文编辑：左双燕)

Genotypes and homology of measles virus isolated from 40 patients with measles in Beijing Xicheng District in 2014

ZHANGJing-bo1,WANGJing-hui1,CUIJing-hui1,YUXia-li2,CHENMeng2

(XichengDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100120,China; 2BeijingCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100013,China)

Objective To understand the genotypes of measles virus isolated from patients with measles in Beijing Xicheng District in 2014, and timely find out imported measles cases. Methods Measles virus nucleic acid was identified with fluorescent polymerase chain reaction (PCR), then amplified by real-time PCR (RT-PCR), amplified products were sequenced and analyzed. Results 82 specimens from 81 suspected measles patients in Beijing Xicheng District in 2014 were taken, 63 were throat swab specimens and 19 were urine specimens. 70 cases were positive for measles virus nucleic acid, 40 of which were obtained gene sequence through sequencing, 37 were positive culture for measles virus. The phylogenetic tree analysis showed that gene sequences of 40 measles virus isolates were belonged to the same branch as H genotype representative strain Chin9322/H1a and MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1 recommended by World Health Organization. The homology of nucleotide were 98%-98.9% and 96.9%-97.8% respectively, homology of amino acid were 97.3%-99.3% and 95.3%-98% respectively. Conclusion The main genotype of measles cases in Beijing Xicheng District in 2014 was the local genotype (H1), surveillance of measles cases should be strengthened further to control and prevent the imported measles cases.

measles virus; nucleic acid detection; genotype H1;epidemiology

2015-12-14

张晶波( 1970-),女(汉族)，吉林省白城市人，主任技师, 主要从事微生物检验研究。

张晶波 E-mail：jingbo7099@hotmail.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.10.015

R373.1+1

A

1671-9638(2016)10-0780-05