超声波提取羊耳菊黄酮类化合物的工艺研究

杨　敏，刘孟吉

（吉林农业科技学院，吉林　吉林　132001）

超声波提取羊耳菊黄酮类化合物的工艺研究

杨敏，刘孟吉

（吉林农业科技学院，吉林吉林132001）

为了研究羊耳菊最佳工艺，试验采用超声的方法来提取羊耳菊中黄酮类化合物，确定最佳的提取工艺条件。试验采用单因素和正交试验，分析乙醇浓度、料液比、提取时间及提取温度等四个因素对黄酮类化合物含量的影响，优化提取工艺条件。结果表明：乙醇浓度60%，料液比为1：10、提取时间为10min、提取温度为60℃，黄酮含量可以达到69.82mg/g。优选提取工艺简单可行，速度快，可提高葛花人参中有效成分的收率。

羊耳菊；超声波；黄酮类化合物；提取工艺

羊耳菊（Inula cappa（Buch-Ham）DC.），系菊科旋覆花属植物，亚灌木，根状茎粗壮［1］。具有除风散寒，行气止呕，止汗，止泻，止血的功效。临床上用于治疗感冒发烧、喉炎、咳嗽咳血、虚痨、心悸、月经不调及产后流血等症，疗效肯定，具有很高的研究开发价值［2］。其主要化学成分为黄酮类化合物。黄酮类化合物因其结构和来源的不同，溶解性差异也很大，因此应根据其极性和溶解性来选择合适的提取溶剂［3］。本试验采用超声提取方法，以黄酮类化合物的含量主要考察指标，采用正交试验法探讨了不同提取条件对黄酮含量的影响，为羊耳菊抗炎活性药理研究奠定了基础。

1　材料与仪器

1.1材料

羊耳菊在吉林大药房购买，由武晓琳老师鉴定为羊耳菊。

芦丁标准品（中国药品生物制品检定所供紫外法含量测定用）；95%乙醇溶液 （天津市光复科技发展有限公司）；氢氧化钠（分析纯）；亚硝酸钠（分析纯）；硝酸铝（分析纯）

1.2仪器

766-2型远红外辐射干燥箱 （南通科学仪器厂）；ALC-310电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；LG-08A型高速万能粉碎机 （天津市泰斯特仪器有限公司）；试验筛（新乡市同心机械有限责任公司）；UY-1700紫外可见分光光度计 （日本岛津）；SHB-III型循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）；SY-360超声波清洗机（上海宁商超声仪器有限公司）。

2　试验方法

2.1工作曲线回归方程的建立

将芦丁干燥至恒重，制成标准样品，精密称取芦丁10mg，用60%的乙醇溶解并稀释至50mL。作为芦丁标准液。精密量取0，1，2，3，4，5mL芦丁标准液，分别置100mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶 1mL，混匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以试剂空白作参比，用分光光度法分别在500nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

2.2羊耳菊中黄酮类化合物的提取

2.2.1提取物的制备

准确称取羊耳菊粉末4g，加入60%乙醇溶液80mL，在温度为60℃、频率35KHZ、功率360W的情况下提取15min，减压抽滤，将滤液转移至100mL容量瓶中定容至刻度，备用。

2.2.2样品黄酮含量测定

精确量取0.5mL样品液至25mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液1mL，摇匀，放置6min，加10% Al（NO3）3溶液1mL，摇匀，放置6 min，加4%NaOH溶液10mL，然后用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min。用分光光度法在波长为500nm处测定吸光度，根据回归方程计算样品中黄酮类化合物含量［4］。

2.3单因素试验

2.3.1乙醇浓度对黄酮提取效果的影响

改变乙醇溶液浓度其他条件不变，分别加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液80ml进行提取，测定吸光度值，计算黄酮含量。

2.3.2料液比对黄酮提取效果的影响

改变料液比其他条件不变，用不同的料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15）进行提取，测定吸光度值，计算黄酮含量。

2.3.3超声波提取时间对黄酮提取效果的影响

改变提取时间其他条件不变，分别提取10min、15min、20min、25min、30min。测定吸光度值，计算黄酮含量。

2.3.4超声波提取温度对黄酮提取效果的影响

改变提取温度其他条件不变，分别用提取温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行提取，测定吸光度值，计算黄酮含量。

2.4正交试验

以乙醇为浸提溶剂，采用超声波提取法，设计正交实验考察溶剂浓度、提取时间、料液比、温度这4个因素，每个因素取3个水平，以黄酮含量为考察标准，优选出最佳提取条件。选L9（34）作正交试验，统计试验结果。

3　结果与分析

3.1芦丁标准曲线的制作

用Excel软件进行线性回归分析，得线性回归方程，绘制芦丁浓度C与吸光度的标准曲线。测得值最小二乘法进行线性回归，分析得回归方程y= 1.0412x+6.1×10-3，相关系数R2=0.9993，说明其线性关系良好。

3.2单因素试验结果

3.2.1乙醇浓度对黄酮提取影响结果

图1　乙醇浓度对总黄酮提取的影响曲线

由图1可见总黄酮含量随着乙醇浓度增加而逐渐增长，但当乙醇浓度达到60%时黄酮提取率反而降低。这是因为随着乙醇浓度的增大，会使提取品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低，影响提取物有效含量。所以设计正交试验乙醇浓度三个水平为50%、60%、70%。

3.2.2料液比对黄酮提取的影响结果

图2　料液比对黄酮提取的影响

由图2可以看到黄酮含量随料液比增加变化不大，极差仅为0.81，料液比在1：25时黄酮含量最高。所以将料液比不作为考察因素，将其作为空白组。考虑实际操作中料液比过小时，提取剂太少不利于过滤分离，提取剂太多过滤时间太长。所以选择料液比在1：9。

3.2.3超声波提取时间对黄酮提取的影响结果

图3　提取时间对黄酮提取的影响

由图3可知10～15min时黄酮含量增加明显，之后黄酮含量变化不大。由此可以看出，15min之后再延长提取时间对黄酮含量影响不大。造成提取物在超声作用达到一定时间后，黄酮含量增加缓慢或呈下降趋势的原因可能是在长时间超声作用下，黄酮含量逐渐向极限值靠近，致使提黄酮含量增幅降低。同时超声作用时间太长，会使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低，影响提取物有效含量。所以选择提取时间为10、15、20min为正交试验的三个水平。

3.2.4超声波提取温度对黄酮提取的影响结果

图4　超声波提取温度对黄酮提取的影响

有图4可见当温度在60℃时黄酮含量达到最大值，之后黄酮含量反而降低。这可能是因为随着温度的提高，杂质的溶出也相应增加，致使黄酮含量的提取逐渐降低。所以选择50、60、70℃为正交试验的三个水平。

3.3正交试验结果分析

由单因素试验可看出料液比对黄酮含量影响不大，因此将料液比作为空白组。即以乙醇浓度（因素A）、提取时间（因素B）、提取温度（因素C）进行正交试验设计，同时对实验结果分析，因素水平安排表见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1　正交试验因素与水平安排表

表2　正交试验设计及结果

通过正交试验和数据处理（表3）考虑A、B、C三因素在三个水平上的变化，得出最佳提取条件，由极差分析可以看出，影响提取羊耳菊中黄酮类化合物含量的因素主次顺序为A＞C＞B。从平均黄酮含量看，A2B1C2提取条件最好，即乙醇浓度为60%、提取时间为10min、提取温度为60℃的时候提取条件最好。

表3　方差分析

由表3方差分析可知，乙醇浓度对实验结果的影响非常显著，提取温度对黄酮含量比较显著。由此得出结论3种因素显著性的强弱依次为：乙醇浓度＞提取温度＞提取时间。因此提取条件最好，即乙醇浓度为60%、提取时间为10min、提取温度为60℃的时候提取条件最好。

3.4最佳工艺试验验证

取三份羊耳菊粉末各4.00g，按照最佳提取条件平行操作测定吸光度，并计算平均黄酮含量为67.32mg/g，3次实验结果经计算RSD=0.797%。实验工艺条件重现性好，因此以正交实验确定的最优组合为最佳提取工艺条件，见表4。

表4　验证试验

4　结论

本实验是以羊耳菊为原料，利用超声波对黄酮类化合物提取工艺进行研究。通过单因素试验和正交试验设计考察不同因素对羊耳菊提取液中黄铜类化合物含量的影响。最佳工艺条件为：乙醇浓度为60%，料液比为1：9、提取时间为10min、提取温度为60℃，黄酮含量可达69.82mg/g。其中乙醇浓度对黄酮提取影响最为显著。

根据相关文献记载，与传统的回流浸提法相比较，超声波法提取法操作简单、省时，提高了有效成分的提取率、原料的利用率。

［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第75卷）［M］.北京：科学出版社，1985：271.

［2］ 中国医学科学院药用植物资源开发研究所，等编著.中药志（Ⅳ）（第二版）［M］.北京：人民卫生出版社，1988：368.

［3］ 李胜华.超声波提取鱼腥草叶总黄酮优化工艺研究［J］.食品科学，2006，27（12）：270-273.

［4］ 乔俊缠.线叶菊总黄酮含量测定［J］.中草药，1998，29（7）：453-454.

R284.1