一种多孔质固定化酵母在糖蜜酒精生产中的应用研究

郭艺山，尚红岩，黄向阳，高俊永，高亚飞，苏江滨，徐日益，梁 磊，3

（1.广州甘蔗糖业研究所；2.广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室；3.广东省生物质高值化利用工程实验室，广东 广州 510316）

一种多孔质固定化酵母在糖蜜酒精生产中的应用研究

郭艺山1，2，尚红岩1，2，黄向阳1，2，高俊永1，2，高亚飞1，2，苏江滨1，2，徐日益1，2，梁 磊1，2，3

（1.广州甘蔗糖业研究所；2.广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室；3.广东省生物质高值化利用工程实验室，广东 广州 510316）

文章主要探讨一种新的固定化酵母载体制备方法，以多孔钢渣、硅藻土和珍珠岩等材料为细胞宿主载体，采用空化制泡工艺制备成多孔质固化载体，并应用于糖蜜酒精发酵中。经试验结果表明，该载体具有良好的机械强度、传质效率以及优良的发酵特性。

多孔质；固定化酵母；糖蜜酒精

目前，我国利用制糖工业中的副产物糖蜜发酵生产酒精工艺过程，已经广泛采用多孔圆柱体（蜂窝煤状）固定化酵母载体进行连续发酵，同传统酒精发酵工艺相比，固定化酵母具有发酵周期短、设备利用率高、杂菌感染少、发酵率高、生产成本低等优点。这种载体一般以聚乙烯醇（PVA）为主要固定基材，PVA经过高温溶解、冷却、添加酵母液或酵母泥后冷冻成型、包装及冷冻保藏，在产品到达用户地后还需要经过一定时间的解冻、活化环节，以唤醒休眠的酵母菌，且由于固定化酵母载体形成致密的结构性质，固定基材内的酵母与发酵液发生传质的速率大大降低，载体内酵母增殖速度慢，严重影响初期发酵液中酵母菌达到增值平衡点的速率［1-4］。本文创新的尝试一种方法制备固定化酵母，该方法主要引入空化制泡制备的工艺特点及以多孔钢渣、硅藻土、陶土和珍珠岩材料中的一种或两种以上的混合物作为细胞宿主载体，以期改善载体内部结构，增强固定化酵母产品性能，提高生产效率。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗糖蜜：85°Bx，广东某企业酒精生产用糖蜜。

菌种：高活性糖蜜酒精酵母粉SIRI08-11（广州甘蔗糖业研究所保藏）。

活化培养基：配制16°Bx糖蜜加0.2%尿素，pH 3.2，115℃下灭菌30min。

发酵培养基：配制32°Bx糖蜜加0.2%尿素，pH 4.0，115℃下灭菌30min。

1.2 方法

1.2.1 多孔固定化酵母载体制备方法

将10%PVA于80～100℃溶解于水中得到PVA溶液，然后将PVA溶液冷却至35℃以下，再加入复合酵母液搅拌混合均匀，得到酵母混合液；然后将酵母混合液在0～30℃进行空化制泡、倒入模具中冷冻成型，得到所述多孔固定化酵母。

其中，上述的复合酵母液包括海藻糖0.1%～1.0%，糖蜜0.5%～2.0%，细胞宿主载体0.5%～2.5%（漂洗处理后的粒度为500目～10mm多孔钢渣、硅藻土、陶土和珍珠岩材料中的一种或两种以上的混合物），酵母干粉5%～10%。空化制泡是指在0.01～0.3MPa压力下通过压缩空气的微孔制泡系统进行空化制泡，或通过旋转机械制泡系统进行空化制泡。

1.2.2 PVA固定化酵母的制备

方法以固定化酵母载体制备基本工艺，10% PVA为细胞宿主载体，无空化制泡工艺流程。

1.2.3 PVA-海藻酸钠固定化酵母的制备

方法以固定化酵母载体制备基本工艺，10% PVA和1%海藻酸钠为细胞宿主载体，无空化制泡工艺流程。

1.2.4 多孔质固定化酵母载体应用性能评价

1.2.4.1 多孔质固定化酵母载体的机械强度评定［5］

采用按压法：以载体所能承受的最大压力来表征机载体的械强度。在自制正方形小盒内均匀分布随机选取3颗固定化载体颗粒，用轻的玻璃片盖在上面，将50g法码压在轻玻璃片上，计时60s，施压前后分别用0～150mm游标卡尺测量载体颗粒的直径D和d，计算出两者差值△d。则可得单个载体颗粒的机械强度为：Pi=50·△d-2，其中△d三次测定平均值。载体颗粒的平均机械强度为测量组的平均值P（g·mm-2）为测量3组平均值。

1.2.4.2 多孔质固定化载体酵母的传质效率评定

无菌条件下，在三角瓶内装入100mL浓度为1mol/mL的标准葡萄糖溶液，并随机取30粒载体颗粒装入三角瓶中浸泡，将三角瓶置于30℃恒温培养箱中保存24h，在波长为540nm条件下，浸泡前后用DNS法测定葡萄糖溶液浓度，该固定化载体的传质性能可由浸泡前后葡萄糖溶液浓度差来表征。浓度差值越大表明载体颗粒的传质性能越优良。为消除背景干扰，对照组以同样的方法处理空白载体颗粒过滤液。

1.2.4.3 多孔质固化酵母载体发酵特性的评定［6-7］

第一，起种活化时间的测定，称取解冻后的3g不同类型载体接入150mL糖蜜活化培养基，置于30℃恒温培养并开始培养计时，待活化液锤度降至10°Bx时，记录为起种活化时间。

第二，糖蜜酒精发酵，按一定的接种量将固定化酵母置于糖蜜活化培养基中，并在30℃条件下摇床培养20h，然后取出固定化酵母洗净后转入装有糖蜜发酵培养基带有发酵栓的三角瓶中，32℃条件下静态发酵，间隔一定时间称重，测CO2累积生产量，即失重，通过CO2生成的速率（g·h-1）反映发酵的快慢。待发酵终止，测定成熟醪酒份与残糖含量。

以此综合评定载体的发酵特性。

1.2.5 多孔质固化酵母载体空化制泡方式对发酵特性的影响

分别制备对不同空化制泡工艺制备的固化酵母载体进行对比发酵试验，以发酵过程CO2生成效率来评定。

2 结果与分析

2.1 多孔质固化酵母载体的物理性能

通过测定多孔质固化酵母，PVA-海藻酸钠固化酵母及PVA固化酵母三类载体的物理性能，结果见表1。

表1 不同载体固化酵母物理性能对比

由表1可见，机械强度大小分别为：PVA-海藻酸钠固化载体（下文由②表示）＞多孔质固化载体（下文由①表示）＞PVA固化载体（下文由③表示）；传质系数大小分别为：①＞②＞③。在糖蜜酒精连续发酵生产过程中，固化载体的机械强度是决定其能否承受在长期连续发酵过程的流体冲击力，一般而言为满足连续发酵的需求，载体的机械强度越高越好，但是增减载体的机械强度时往往会降低载体的传质性能，而酵母的生长代谢受载体的传质性能影响较大，因此在制备固化酵母载体时需综合比较载体的机械强度和传质性能，综上所述，结合试验结果得出，多孔质固化酵母载体物理性能优于其他两种载体。

2.2 多孔质固化酵母载体的发酵特性

通过对三类固化酵母载体的活化培养及发酵培养，实验结果见表2和图1。

由表2和图1可见，固化酵母载体经冷冻保藏后首次启用，活化用时多孔质载体耗时最短为30h，相比较于PVA-海藻酸钠酵母载体及PVA酵母载体的耗时分别缩短了14.3%与23.1%；发酵成熟醪液的酒度和残糖含量结果显示，三种载体中多孔质固化酵母载体发酵性能最优，所得酒份含量最高，残糖含量最低。综合载体首次活化耗时及发酵培养结果表明，多孔质固化酵母载体具有优异的发酵性能。分析其优异发酵性能的主要原因，可能是由于多孔质固化酵母载体制备过程中采用海藻糖和稀糖蜜做酵母细胞的保护剂，减少了酵母细胞在冻融过程中的损伤，能够有效保护酵母细胞的存活基数；同时，空化制泡工艺提高的酵母细胞宿主载体内部空间网络结构，丰富酵母细胞在载体中生殖代谢的通道，增强发酵过程的传质效率，有效提高发酵效率。

2.3 多孔质固化酵母载体空化制泡方式对发酵特性的影响

通过压缩空气的微孔制泡系统和旋转机械制泡系统进行空化制泡所得两种多孔质固化酵母载体，与传统固化酵母进行发酵对比试验，测定其发酵过程的CO2生成速率，结果见图2。

表2 不同载体固化酵母发酵特性对比

图1 不同固化酵母载体发酵过程中CO2失重对比

图2 不同空化制泡固化酵母载体发酵过程中CO2生成速率对比

从图2可见，发酵过程CO2生成率微孔制泡方式和机械制泡方式均高与传统固化酵母，微孔制泡方式最佳。实验结果表明了，空化制泡方式能够有效的丰富载体内部孔隙，有效增强营养物质在载体内部的传递，使得酵母细胞能够更好的生长代谢。同时也表明了微孔制泡方式相比较机械制泡方式能够更有效的增加在单位体积载体中获得更多的气泡孔隙，获得更好传质性能。

3 小结

通过试验验证了该多孔质固化酵母载体具有较好的机械强度与传质系数等物理性能，同时采用海藻糖和稀糖蜜作为酵母细胞保护剂，提高冷冻后载体内部酵母细胞的存活基数；通过添加细胞宿主载体和空化制泡技术，有效提高固化酵母载体中的空间网络孔隙占比率和产品的活化性能，丰富酵母在载体中生长代谢的传质通道，增大发酵过程的传质效率，提高发酵效率，提高原料利用效率等特点，可满足糖蜜酒精连续生产的需求。

［1］ 李起斌.固定化活酵母连续发酵生产糖蜜酒精［J］.甘蔗糖业，1994，（3）：48-50.

［2］ 张书祥.固定化酵母连续发酵生产酒精工业应用的研究［J］.生物学杂志，1999（3）：27-28.

［3］ 何延青.微生物固定化技术与载体结构的研究［J］.环境科学，2004，25（2）：101-104.

［4］ 邓元修.固定化酵母酒精发酵［J］.华中理工大学学报，1993，21（2）：176-180.

［5］ 刘树文，李华，等.微生物固定化粒子机械强度的研究［J］.微生物学杂志，2005，25（4）：32-34.

［6］ 梁秉华，程群卿，等.编写.甘蔗糖蜜酒精生产检验方法［M］.轻工业部甘蔗糖业研究所，1986：4547.

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TS249.3

B

2095-820X（2016）04-04

2016-06-24

广东省科技计划项目（2013B010102002）；广东省科技计划项目（2014A010107017）；广东省省级科技计划项目（2016B070701005）；广东省科学院科研平台环境与能力建设专项资金项目（2016GDASPT-0208）。

郭艺山（1984—），男，福建漳州人，工学硕士，工程师，研究方向：制糖综合利用与工业微生物代谢与调控，E-mail：279589449@qq.com。