钙镁磷肥对青枯病发病烟株根际土壤微生物区系的影响

李小龙，李红丽，曾强，郭夏丽，王岩

1 南平市烟草公司邵武分公司，福建邵武市华光路闽星花园烟草大楼 354000；2 郑州大学化工与能源学院，河南郑州高新区科学大道100号 450001

钙镁磷肥对青枯病发病烟株根际土壤微生物区系的影响

李小龙1，李红丽2，曾强1，郭夏丽2，王岩2

1 南平市烟草公司邵武分公司，福建邵武市华光路闽星花园烟草大楼 354000；2 郑州大学化工与能源学院，河南郑州高新区科学大道100号 450001

采用平板计数法分析了不同生育期及发病烤烟根际可培养微生物数量的变化，并通过宏基因组测序法比较了施用钙镁磷肥的健康与发病烟株根际土壤微生物群落的差异，旨在研究钙镁磷肥对烟株根际土壤微生物群落多样性的影响。结果表明：1）施用钙镁磷肥的烤烟根际细菌和真菌数量随生育进程呈抛物线形式变化，对照则呈“N”趋势，处理和对照的根际放线菌数量变化趋势相同，呈逐渐增加的趋势。2）在旺长期，施用钙镁磷肥的根际细菌数量显著高于对照；在成熟期，处理的根际真菌数量显著高于对照；而钙镁磷肥对根际放线菌数量没有显著影响。3）相对于健康烟株根际土壤，发病烟株根际土壤中放线菌数量显著减少，细菌数量显著增加；发病根际土壤中施用钙镁磷肥的细菌和放线菌数量均显著高于对照。4）宏基因组测序结果显示根际细菌种类总数远高于根际真菌，健康根际细菌和真菌香农指数、Chao1指数和ACE指数均高于发病根际土壤。综上所述，钙镁磷肥对根际土壤微生物数量和多样性有一定的促进作用。

钙镁磷肥；烟草青枯病；根际微生物

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土传细菌病害，严重危害烤烟生长[1-2]。目前青枯病的防治方法有提高烟株抗性[3-4]，药剂防治[5-6]和生物防治[7-10]等。烟株的抗性受多方面因素制约的，一个抗病品种往往在最初几年表现抗病，但随着种植年限延长，病菌致病力改变，品种抗病性会丧失[11]。药剂防治虽然有一定防治效果，但是长期大量的施用化学药剂易使病菌产生耐药性，使烟草残留药剂，造成环境污染[12]。通过施入微生物有机肥的生物防治方法，可以改善根际微生态环境，增强抗病性。虽然生物防治受到国内外学者的广泛重视，但实际应用仍受到一定限制，因此青枯病的防治仍然是一大生产难题。

植物根际是一个由植物、土壤、微生物组成的生态系统，其中的土壤微生物区系与植物病害发生关系密切[13-14]，探索两者的关系对于烟草青枯病的防治具有重要的理论和实际意义。目前有关钙镁磷肥对烤烟青枯病土壤微生物区系影响的研究还未见有报道，本研究在烤烟大田生长的不同时期，分别采集土壤，调查钙镁磷肥对根际微生物区系数量动态变化的影响，并分析了成熟期发病土壤微生物数量及优势菌群组成，旨在为更好地进行土壤改良、开发防治青枯病的土壤改良剂和微生物制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设置

试验于2013年在福建邵武市沿山镇徐溪村进行。选取地势平坦、肥力相对均匀、往年青枯病发病严重的地块作为试验田，试验田为中壤土，pH值5.16，有机质含量27.58 g/kg。试验设置2个处理，3次重复，共6个小区，随机排列。供试烟叶品种为云烟87，第小区种植250株，株行距50×120 cm。烟田施用纯氮量为9.09 kg／667 m2，氮磷钾比例为1:0.8:2.7，大田管理按邵武市优质烟生产技术规程进行。

各处理具体设置如下：

T1处理（CK）：对照（当地常规施肥与管理，即只施烟叶专用肥、化肥、有机肥等，不施钙镁磷肥）；

T2处理：钙镁磷肥（将对照中磷肥用量的30%以钙镁磷肥替代，钙镁磷肥（50kg/袋）：有效磷15%；CaO≥30%；MgO≥6%；SiO2≥20%。）

1.2 试验方法

1.2.1 根际土壤样品采集

随机选取15株烤烟，将整个烟株的根连同根部土壤一起取出，去掉根部一些大土块，轻轻将粘接在细根上的土壤抖落并混匀，存放于4℃冰箱内待测。

1.2.2 微生物培养与计数

土样经过梯度稀释，采用固体平板混匀浇注法进行计数。不同种类微生物的培养基分别是：细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌采用高氏1号合成培养基；真菌采用马丁孟加拉红培养基。

1.2.3 宏基因组16S rDNA及18S rDNA测序

在施钙镁磷肥的植烟田中采集的发病和未发病根际土送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行宏基因组分析。PCR所用的细菌引物(融合了Miseq测序平台的V1-V3通用引物)：融合F引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN+bar+AG RGTTYGATYMTGGCTCAG；融合R引物：GAC TGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA+ACC GCGGCKGCTGGC。真菌引物（18S通用引物）：融合F引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN+bar+GTAGTCATATGCTTGTCTC;融合R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAA TTCCCCGTTACCCGTTG。PCR结束后，对PCR产物进行琼脂糖电泳，采用生工琼脂糖回收试剂盒（cat:SK8131）对DNA进行回收。回收产物用Qubit2.0定量，根据测得的DNA浓度，将所有样品按照1:1的比例进行混合；混合后充分震荡均匀。该混合样品用于后续的样品建库（加测序标签）与测序。测序后去除序列中非扩增区域序列，而后用mothur中的pre.cluster软件进行测序错误校正，最后采用uchime去除序列中的嵌合体。采用RDP classi fi er软件对处理后序列进行物种分类，采用Naïve Bayesian assignment算法对第条序列在genus水平上计算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8。

1.2.4 病情调查

从烟草青枯病发生开始调查实验小区发病株数及病级。以后第隔15天调查一次，共调查4次。烟草青枯病的发病率=发病株数/调查总株数×100%；病情指数分级：0级：全植株无病；1级: 茎部偶有褪绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎；2级: 茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧1/2以上叶片凋萎；3级: 茎部黑色条斑到达株顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎； 4级:病株基本枯死。病情指数=[∑(病情级数×此级病株数)/(最高级数×调查总株数)]×100。

1.3 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel和DPS数据处理统计软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 钙镁磷肥对烤烟不同生育期根际微生物区系数量变化的影响

施用钙镁磷肥（T2）的根际细菌数量与真菌数量在生育期内均呈先增加后减少的变化趋势（图1），根际细菌数量在旺长期达到最大，根际真菌数量在成熟期达到最大。而对照（T1（CK））根际细菌数量与真菌数量在生育期内均呈先增加后减少又增加的变化趋势。施用钙镁磷肥的根际细菌数量在旺长期显著高于对照（p＜0.05），真菌数量在成熟期显著高于对照，而处理和对照的放线菌数量变化趋势相同，在生育期内数量一直增加，而且各个阶段的数量均没有显著差异。

图1 钙镁磷肥对烤烟不同生育期根际可培养微生物数量的影响Fig.1 Effects of calcium-magnesium phosphates on quantity of culturable microbe in rhizosphere soil of tobacco plant at different growth stages

2.2 钙镁磷肥对健康与发病根际土壤中可培养微生物数量的影响

由表1可知，施用钙镁磷肥对青枯病的发生起到一定抑制作用，但抑制作用不大。发病根际土壤中细菌数量显著高于健康根际土壤，但放线菌数量显著低于健康根际土壤，说明放线菌类群在根际健康方面可能起一定的促进作用。

健康根际土壤中钙镁磷肥对放线菌数量没有影响，而在发病根际土壤中，施用钙镁磷肥的放线菌数量显著高于对照，表明钙镁磷肥可能在一定程度上影响了放线菌数量的减少，这可能与钙镁磷肥的抑病作用有一定相关性。健康根际土壤中施用钙镁磷肥的细菌和真菌数量均显著低于对照，而发病根际土壤中施用钙镁磷肥的细菌数量显著高于对照，真菌没有显著变化，推测钙镁磷肥可能有助于发病根际中部分非病原细菌与病原菌进行营养竞争或空间竞争，对发病根际中部分非病原细菌菌与病原菌的相互作用可能有一定刺激作用，从而导致一定的抑病作用。

表1 不同处理健康与发病根际土壤中不同微生物区系数量的显著性比较及其发病情况Tab.1 Comparison between cultured microbial fl ora in the rhizosphere soil of healthy and wilted tobacco under different treatments and their respective incidence cfu·g-1

2.3 施用钙镁磷肥烤烟健康根际与发病根际微生物群落结构的比较

宏基因组测序及数据分析结果表明，对于细菌类群，烟草根际主要富集了变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和未分类菌群(unclassi fi ed)的成员，其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和绿弯菌门（Chloro fl exi）。其中只有浮霉菌门的丰度在发病根际中较高。根际占优势的细菌属主要有Lysobacter，Singulisphaera，Longilinea，Mesorhizobium，Sphingosinicella，Bradyrhizobium，Pseudolabrys，Sphingomonas，Arthrobacter，Gemmatimonas和Pseudomonas，除Singulisphaera属外，其他所有优势属的丰度在健康根际中均较高。

从表2可以看出，2个土壤样品的 16S rDNA 克隆文库的覆盖率均达到70%以上，说明所建文库能真实的反映出样品的细菌多样性特性。Chao1和 ACE指数可以反映样品的群落丰富度，其值越高表明群落物种的丰富度越高，而Shannon 指数可以反映样品的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性越高。结果表明健康根际土壤（TA）中细菌丰富度和多样性要高于发病根际土壤（TB）。细菌类群和多样性指数的分析结果都一致表明健康烟株根际土壤细菌多样性程度较高，细菌群落结构优于发病根际土壤。

表2 土壤根际细菌和真菌群落多样性指数Tab.2 Diversity indices of bacterial and fungal community in rhizosphere soil

对于真菌类群，烟草根际主要富集了壶菌门（Chytridiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）、毛霉菌亚门（Mucoromycotina）、担子菌门（Basidiomycota），和未分类菌群（unclassi fi ed）。其中，子囊菌门是TA样品中真菌菌群的第一优势菌群，占总克隆数的54%，其次是一个未分类的真菌类群（31%）。发病根际土中未分类的真菌类群占总克隆数的47%，子囊菌门占39%。样品TA的子囊菌门和毛霉亚门的丰度显著大于样品TB，而其担子菌门和壶菌门则呈相反趋势。健康根际占优势的属主要有Mortierella，Geosmithia，Mucor，Absidia和Ascobolus。发病根际中优势属有Mortierella，Geosmithia，Mucor，Conocybe和Collophora。其中，除Mortierella外，Geosmithia和Mucor在健康根际中的丰度较高。

2个土壤样品的18S rDNA文库的覆盖率均达到97%以上（表2），表明文库基本涵盖烟株根际土壤中所有真菌类群。从多样性指数可以看出，健康根际土壤的Shannon指数、ACE指数和Chao1指数均高于发病根际土壤，结合上述真菌类群分析，健康根际土壤的真菌种类多样性高于发病根际土壤，但差异不如细菌类群显著，而且真菌物种数量远低于细菌物种。

3 讨论与结论

（1）比较不同时期根际可培养微生物数量变化可知，根际不同微生物区系在不同时期分布为细菌＞真菌＞放线菌，细菌在各个时期土壤微生物组成中都占绝对优势，说明它对根际微生态的稳定及根际养分的供应起重要作用。在烤烟旺长期，施用钙镁磷肥处理的根际细菌数量显著高于不施用钙镁磷肥处理，表明在需肥的旺长期，钙镁磷肥的施用促进了根际细菌数量增加。

（2）比较健康与发病根际可培养微生物区系数量发现，施肥与对照的发病根际细菌数量均显著高于健康根际，推测青枯病菌可能诱导了根际环境发生相应变化[15]，从而造成可培养细菌数量的增加，另外，根际病菌数量的增加也可能是其中原因之一。

（3）通过对根际土壤宏基因组的分析发现，Proteobacteria是细菌菌群中的第一大类群，占克隆总数的50%左右，其中，α-proteobacteria为优势的Proteobacteria，占30%左右。α-proteobacteria中的优势菌属有Mesorhizobium、Sphingosinicella、Pseudolabrys、Bradyrhizobium、Sphingomonas。其中Mesorhizobium和Bradyrhizobium为共生固氮菌，能将分子N2转化为NH3[16]。而Sphingomonas能够代谢多种碳源，能够利用有毒污染物如多环芳烃进行生长[17]。γ-proteobacteria中的优势菌属有Pseudomonas和Lysobacter。Pseudomonas具有代谢多样性，可利用的碳源种类广泛，如甲醛及芳香化合物等[18]，而且具有一定的生防作用[19]。Lysobacter是一种重要的生防细菌，对多种植物病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌以及线虫等具有溶菌作用[20-21]。优势属Singulisphaera归属于浮霉菌门[22]，研究表明浮霉菌门中有些微生物具有厌氧氨氧化作用，与氮素转化有关。相对于细菌，Ascomycota和Basidiomycota两大真菌类群，与常见的木质纤维降解菌群相关性较大，它们当中绝大多数菌属在土壤木质纤维碳转化过程中发挥着重要作用。总之，在健康的根际生态中生物多样性大，物种之间物质交换和转化途径多样化，协调性增加，可以从物质转化方面保持生态平衡；再者，健康根际中有些丰度较高的优势属具有生防作用，可以抑制病原微生物的生长，维持生态平衡，提高烟株的抗病性。本试验钙镁磷肥的施用对青枯病有一定的抑制作用，表明在以后的防病措施中，不仅要注重拮抗菌的施用，同样要注重提高土壤养分转化的协调性，即加强与养分转化相关的土壤调理剂和微生物制剂的研制和施用。

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Effects of calcium-magnesium phosphates on microbial fl ora in rhizosphere soil of tobacco plant effected withRalstonia solanacearum

LI Xiaolong1, LI Hongli2, ZENG Qiang1, GUO Xiali2,WANG Yan2
1 Nanping Shaowu Tobacco Company, Shaowu 354000, Fujian, China;2 College of Chemical Engineering and Energy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

Plate counting and high-throughput sequencing methods were used to investigate the e ff ects of calcium-magnesium phosphate fertilizer on tobacco rhizosphere microbial fl ora in di ff erent growth periods and in infected soil. Results were as follows: 1) The amount of bacteria and fungi in rhizosphere fi rstly increased and then decreased with calcium-magnesium phosphates, while a trend of "N" was observed for the amount of bacteria and fungi in rhizosphere without fertilizer. The number of actinomyces increased gradually during growth period with and without fertilizer. 2) Fertilizer treatment increased rhizosphere bacterial quantity at rapid growing stage and rhizosphere fungal quantity at mature stage, respectively. However, fertilizer had no signi fi cant in fl uence on actinomyces. 3) In rhizosphere soil of all bacterial wilt infected plants, the growth of actinomyces was relatively restrained, while that of bacteria was promoted. The number of bacteria and actinomyces of fertilizer treatment was significantly higher than that of control in infected rhizosphere. 4)Phylogenetic analysis suggested that representative bacteria were widely distributed. Shannon index, Chao1 index and ACE index of healthy rhizosphere were much higher than that of infected rhizosphere. It was revealed that calcium-magnesium phosphate fertilizer had a positive e ff ect on quantity and diversity of rhizosphere microorganism.

calcium-magnesium phosphate fertilizer; tobacco bacterial wilt; rhizosphere microorganism

李小龙，李红丽，曾强,等. 钙镁磷肥对青枯病发病烟株根际土壤微生物区系的影响[J]. 中国烟草学报，2016,22（1）

福建南平烟草专卖局资助项目（NYK2012-14-3）

李小龙（1980—），学士，助理农艺师，研究方向:烟叶生产技术推广与科研工作,Email：lxl_6764910@163.com

郭夏丽（1966—），博士，副教授，研究方向：微生物技术，Email：xlguo555@sohu.com

2014-05-27

：LI Xiaolong, LI Hongli, ZENG Qiang, et al. E ff ects of calcium-magnesium phosphates on microbial fl ora in rhizosphere soil of tobacco plant e ff ected withRalstonia solanacearum[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)