吸烟对青年吸烟者血浆微小RNA表达谱影响的研究

施冰，张天阳，刘兴余，张杰，周骏，王彦亭

1 北京军区总医院，心内科，北京市东城区南门仓5号，100700；2 上海烟草集团北京卷烟厂，技术中心，北京市通州区万盛南路99号，100141；3 国家烟草专卖局，北京西城区月坛南路55号，100045

吸烟与健康

吸烟对青年吸烟者血浆微小RNA表达谱影响的研究

施冰1，张天阳1，刘兴余2，张杰2，周骏2，王彦亭3

1 北京军区总医院，心内科，北京市东城区南门仓5号，100700；2 上海烟草集团北京卷烟厂，技术中心，北京市通州区万盛南路99号，100141；3 国家烟草专卖局，北京西城区月坛南路55号，100045

目的： microRNA(miRNA)是一类新的用于诊断疾病的生物标志物。目前关于吸烟与血浆miRNA表达谱的研究相对较少。本研究通过血浆miRNA表达谱芯片检测，筛选与吸烟相关的特异性miRNA，为吸烟与健康研究提供一个新的方法。方法：应用人miRNA表达谱芯片检测了28位青年吸烟者和12位非吸烟者血浆miRNA表达谱，筛选了差异表达的miRNA。应用生物信息学方法对差异表达的miRNA进行了功能富集分析。结果：与非吸烟者比较，吸烟者血浆中35个miRNA发生了差异表达。其中24个miRNA表达上调，11个miRNA表达下调。功能富集分析提示差异表达的miRNA与免疫调节、细胞凋亡等生物学功能以及白血病等疾病密切相关。结论：吸烟可导致血浆miRNA表达谱发生变化。差异表达的miRNA可能成为吸烟与健康研究的新靶点。

吸烟；血浆；微小RNA; 表达谱；生物标志物

随着人们对吸烟与健康关系的日趋关注，对吸烟影响健康进而导致疾病患病风险增加的研究已从传统流行病学的宏观统计分析走向与分子流行病学紧密结合的系统性研究。随着代谢组学、化学信息学、生物信息学、基因组学的不断发展与融合，通过分子生物学和生物信息学技术研究吸烟与人类基因表达谱变化进而进一步探索吸烟与疾病之间的关系研究，可能为深入了解吸烟与健康的关系提供一个新的重要研究方向。

microRNA(miRNA)是一类长约18-25个核苷酸的单链非编码小分子RNA，主要通过与靶基因mRNA的3’端非编码区（3’UTR）不完全碱基互补配对方式结合，抑制靶mRNA翻译成蛋白质，在转录后水平调控靶基因的降解或抑制其翻译，从而发挥调控靶基因表达的作用[1]。目前认为，至少约20%-30%的人类基因受到miRNA的调控。越来越多的研究表明，miRNA不仅广泛参与了细胞增殖、分化、凋亡、上皮细胞间质转型、组织器官形成和生长等多种生物学功能，也与疾病的发生、发展，特别是肿瘤的发生、发展、转移等病理过程密切相关[2]。miRNA的表达具有组织特异性和时空特异性，在血清（血浆）中稳定表达[3]。由于循环miRNA具有良好的微侵袭性、高度组织特异性、稳定性、无后加工修饰等特点，血清（血浆）miRNA作为新型的生物标志物已广泛应用于临床诊断和疾病预后评估等方面[4]。但是有关吸烟与血清(血浆)miRNA表达谱的研究相对较少。

本研究应用人microarray芯片检测了吸烟人群外周血miRNA表达谱，筛选了差异表达的miRNA，应用生物信息学方法分析了差异表达的miRNA的富集功能。拟为在基因水平建立一种新的评价吸烟与健康关系的方法提供实验数据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

由于中国的吸烟人群多为男性，故选择60名吸烟男性入选本研究。 吸烟者年龄21-30岁，平均年龄22.3±3.4岁。入选标准：（1）18岁以上的吸烟男性；（2）吸烟指数大于30（吸烟指数=平均第天吸烟支数x吸烟年数）[5]；（3）签署知情同意书。排除标准：（1）目前正在使用其他含有烟草的产品；（2）有滥用药物史或酗酒史；（3）确认为高血压、冠心病、糖尿病、脑血管疾病、肺心病、瓣膜病和其他器质性心脏疾病，有严重的肝肾功能疾病，确诊为呼吸系统疾病或血液系统疾病等。此外，40名年龄匹配的非吸烟健康男性（年龄21-30岁，平均年龄23.1±4.7岁）作为对照组参与本研究。所有研究对象均来自同一单位，生活和工作条件相同。所有实验对象均获得本人知情同意并签署知情同意书，课题研究通过医学伦理审批同意。

1.2 血液样本采集

标本采集时间和方法：60名吸烟者随机分为3组，第组20人。在完成体格检查后所有吸烟人员首先吸食某一品牌的混合型卷烟（焦油量11mg）2周，然后3组人员分别吸食同一品牌的三个不同焦油量的混合型卷烟（ 焦油量3mg, 8mg,11 mg）共计6 周，同组人员均吸食同一品牌同一种焦油量的卷烟。吸烟者根据个人生活习惯第日吸食10～20支卷烟。收集第日吸食卷烟后剩余的烟蒂，-80℃冻存。

分别于吸烟者吸食不同焦油量卷烟的观察期的第14天、28天、42天进行血液样本采集。非吸烟者在体格检查完成后的第2天进行血液标本采集。采集血液样本前晚18时以后禁食，禁饮酒、咖啡、浓茶等。采集空腹肘静脉血 4 mL,置入EDTA抗凝管中。血液样本采集后2 h内离心，4℃，3000rpm/min，离心10 min，血浆转移至无RNA酶的洁净EP管中，－80℃冰箱保存，择期统一进行miRNA检测。

1.3 血浆miRNA的提取和miRNA表达谱芯片检测

应用miRNA提取试剂盒提取血浆miRNA（Qiagen kit），应用Nanodrop仪进行miRNA质量检测，全部100份血浆miRNA均质检合格。选取其中40例质量好的血浆miRNA样本（吸烟组28例，非吸烟者12例）进行human miRNA表达谱芯片检测。应用安捷伦human miRNA microarray芯片（Version 19.0）进行检测，共检测40张芯片。应用Signi fi cance Analysis Microarrays(SAM,Version 3.0)软件挑选差异表达的miRNA。应用Cluster 3.0对差异表达的miRNA进行聚类分析，FDR（False discovery rate）控制在5%以内。

1.4 血浆miRNA实时聚合酶链反应

从microarray芯片检测发现的差异表达的miRNA 中随机选择自身表达丰度高的3个miRNAs（has-miR-16-5p, has-miR-451a, has-miR-486-5p）进一步应用荧光定量PCR方法进行检测，验证芯片的准确性。应用RNA U6作为内参，第个miRNA进行3次荧光定量PCR检测。PCR扩增条件：95℃,15s;60℃,30s,40个循环；75℃至95℃绘制溶解曲线，非变性琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况。

1.5 差异表达的miRNA的功能富集分析

应用生物信息学方法对差异表达的miRNA进行功能富集分析。利用超几何分布假设检验分析差异表达的miRNA的相关功能及相关疾病的富集度，对获得的p 值进行Bonferroni多重比较校正。

1.6 统计学分析

对于 microarray，应用 Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。使用 Agilent GeneSpring 软件对数据进行归一化，采用 GeneSpring软件进行组间的差异分析。采用两组独立样本的t 检验方法进行两组差异表达基因分析，ANOVA 方法进行多组差异表达基因分析。P＜0.05定义为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆miRNA表达谱芯片检测结果

吸烟者与非吸烟者血浆miRNA的microarray比较，共筛选出35个差异表达的miRNA（表达上调＞2倍或表达下调＜0.5倍）。其中24个miRNA 表达上调，11个miRNA表达下调（表1）。

表1 吸烟者和非吸烟者血浆中差异表达的miRNATab.1 Expression difference of miRNAs in the plasma of smokers and non-smokers

has-miR-20b-5p5.039064up has-miR-25-3p3.595638up has-miR-42714.768379up has-miR-42985.516026up has-miR-451a3.819415up has-miR-4738-3p3.590218up has-miR-5196-5p2.078181up has-miR-60762.067823up has-miR-60853.424223up has-miR-61243.564162up has-miR-61272.395435up has-miR-61652.637793up has-miR-93-5p2.631095up has-miR-7d-3p3.208561down has-miR-1227-5p4.2256down has-miR-15874.316864down has-miR-3135b5.213491down has-miR-3940-5p3.098348down has-miR-45302.216615down has-miR-485-3p5.370382down has-miR-4944.935441down has-miR-5724.414798down has-miR-574-3p8.195707down has-miR-60682.692841down

2.2 差异表达的miRNA的荧光定量PCR验证

为验证microarray芯片检测的可靠性，应用荧光定量PCR方法对差异表达的miRNA进行了实验验证。在35个显著差异表达的miRNAs中随机选择了表达丰度高且目前研究广泛的2个miRNAs (has-miR-451a,has-miR-16-5p) ，以及在循环中表达丰度高但差异表达不显著（小于2倍）的has-miR-486-5p进行了荧光定量PCR检测。

参照文献[6]，对芯片数据及荧光定量PCR数据进行了归一化处理，使两者具有可比性。具体方法：从miRNA 芯片得到吸烟者与非吸烟者血浆中不同miRNA的信号平均值，将吸烟者的信号值除以非吸烟者的信号值，得到比值Rarray(吸烟/非吸烟对照)。miRNA的荧光定量PCR(qRT-PCR)计算公式：

Rpcr=EmiR-x∆CP(对照-样本)/ERNAU6∆CP(对照-样本)

公式中，RNAU6 作为内参；E表示扩增效率；CP(crossing point) 表示实时荧光强度显著大于背景值时的循环数。计算miRNA的芯片检测比值Rarray与荧光定量PCR比值Rpcr, 比值大于1表示miRNA表达上调，比值小于1表示miRNA表达下调。相对于内参RNAU6, has-miR-16-5p, has-miR-451a, has-miR-486-5p的表达在芯片检测和荧光定量PCR检测中均上调。荧光定量PCR检测结果与芯片检测结果一致（图1）。

图1 miRNA的芯片检测和qRT-PCR检测结果Fig.1 Quantitative PCR validation and microarray results of miRNA

2.3 差异表达的miRNA的功能富集分析

应用TAM 工具 (http://202.38.126.151/hmdd/tools/tam.html)对差异表达的miRNA进行功能富集分析。通过富集分析，我们发现表达上调的miRNA和32种疾病条目具有显著差异，见表2（蓝色条目）。分析这32条疾病条目发现：表达上调的miRNA与乳腺癌、结肠癌、肺癌等实体瘤以及血液系统肿瘤密切相关。表达上调的miRNA和12条生理过程条目具有显著差异，见表2(红色条目)。分析这12条生理过程条目发现：表达上调的miRNA与凋亡、细胞死亡、血管生成等组织发育、免疫有着极为密切的联系。

表达下调miRNA和prion disease (P=0.02), Ischemia(P=0.03)，SARS (P=0.03)以及Cocaine-related disorders(P=0.04)等有关，但对p-value经过FDR校正之后，差异均不显著。

表2 吸烟者血浆中差异表达miRNA所富集的分子功能和疾病条目Tab. 2 Enriched function categories and diseases of miRNAs with signi fi cantly different expression in the plasma of smokers and nonsmokers

续表2

3 讨论

研究报道，吸烟可导致血浆中微泡和miRNA签名发生变化[7]。吸烟也可诱发肺组织、食道、肝细胞miRNA表达发生变化[8-10]。日本学者比较了11名吸烟者和7名非吸烟者血浆miRNA表达谱，发现慢性吸烟可影响血浆miRNA表达谱变化，而急性环境暴露并不影响血浆miRNA表达谱变化[11]。本研究应用的Agilent人miRNA表达谱芯片检测的miRNA总数为1875个。我们将吸烟者与非吸烟者血浆miRNA表达谱进行了比较。芯片表达谱分析共发现35个差异表达的miRNA，其中表达显著上调的有24个，表达显著下调的有11个。尼古丁敏感的Has-miR-140-3p 在吸烟人群血浆表达显著上调。对尼古丁和苯并芘应激反应最敏感的has-miR-16在吸烟人群血浆表达也显著上调。结果提示，研究吸烟者血浆中特异性miRNA表达变化，可为“吸烟与健康”的关系研究提供新的研究思路和研究靶点。

卷烟烟气中含有一氧化碳、亚硝胺等化学物质，这些物质可通过染色体畸变、DNA损伤等多种交叉途径引发细胞损伤[12-13]。由于miRNA大多位于基因的脆性位点上，导致miRNA容易受到毒物攻击而导致表达改变。NNK是一种烟草特异性致癌物，广泛存在于各类烟草制品中。文献报道，雄性大鼠饮水中持续喂饲10 ppM 的NNK 20周可导致大鼠肺组织miRNA表达变化[14]。我国科研人员发现，雄性大鼠皮下注射NNK 1.15mg/kg,第周3次，连续皮下注射20周可导致肺癌发生，大鼠血清中miR-206和miR-133b表达显著上调，肺癌组织miR-206和miR-133b表达显著降低[15]，提示循环miRNA可能成为NNK诱导肺癌发生的潜在生物标志物。

文献报道，吸烟者易患白血病[16]，父母吸烟者，其子女易患白血病的发病率增高[17-18]。究其原因，考虑尼古丁暴露导致原代miRNA表达谱发生变化，这种变化可影响子代和孙代miRNA的表达[19]。吸烟者易发生心律失常、房颤，其原因与吸烟者血浆中miR-1202表达发生变化进而促进心肌纤维化以及房颤的发生有关[20]。吸烟导致差异表达的miRNA的靶基因与肿瘤中吸烟调节的基因有很强的相关性[21]。文献报道miRNAs（has-miR-107, has-miR-140-3p,has-miR-15a-5p, has-miR-16-5p）在白血病患者血浆中表达升高[22],血浆中的miR-17-5p， miR-185-5p,miR-19a-3p,miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-25-3p,miR-451a, miR-93-5p,miR-4738-3p在肝癌、食道癌、膀胱癌等肿瘤中差异表达[23-25]。提示吸烟者血浆中差异表达的miRNA可能是诱发房颤、白血病、肿瘤等疾病发生的危险因素。

本研究中，我们通过miRNA功能富集分析发现，吸烟导致血浆中差异表达的miRNA的功能涉及免疫调节、激素调节、细胞凋亡、血管生成、AKT信号通路等生物学进程。通过研究吸烟与血浆miRNA表达谱变化，以及miRNA与疾病之间的关联度分析，有助于帮助了解卷烟烟气中的有害化学物质对机体的影响及可能导致疾病发生的分子作用机制，可为烟草制品提供一种新的检测有害物质的生物标志物。为通过烟叶改良、卷烟工艺改良等技术手段干预差异表达的miRNA，进一步降低吸烟对健康的危害提供新的思路和研究方法。

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Effect of cigarette smoking on plasma microRNA expression pro fi le

SHI Bing1, ZHANG Tianyang1, LIU Xingyu2, ZHANG Jie2, ZHOU Jun2, WANG Yanting3
1 Department of Cardiology, Beijing Military General Hospital, Beijing 100700, China;2 Technology Center, Beijing Cigarettes Factory, Beijing 100141, China;3 State Tobacco Monopoly Administration, Beijing 100045, China

Objective: Circulating microRNA (miRNA) is recognized as potential biomarkers of various diseases. This study aims to explore whether the level of circulating miRNA in smoker vary with cigarette smoking by using plasma miRNA expression profile to detect smoking-related speci fi city of miRNA. Methods: In this study, the miRNA expression pro fi les of 28 young smokers and 12 non-smokers were determined by Agilent human MicroRNA array. The enrichment function of di ff erentially expressed miRNAs induced by cigarette smoking was analyzed by bioinformatics method. Results: 35 miRNAs were di ff erentially expressed between smokers and non-smokers.24 miRNAs were up-regulated and 11 miRNAs were down-regulated in the smokers. Bioinformatics analysis indicated that dysregulated miRNAs was related to immune system and hormones regulation. Conclusion: Cigarette smoking changed plasma miRNA expression pro fi le in smokers. As a biomarker, miRNA may help to understand the mechanisms by which disease responds to toxic substances included in tobacco smoking.

cigarette smoking; plasma; microRNA; expression pro fi le; biomarker

施冰，张天阳，刘兴余,等. 吸烟对青年吸烟者血浆微小RNA表达谱影响的研究[J]. 中国烟草学报，2016,22（1）

上海烟草集团北京卷烟厂资助项目(No. JZ13005)

施冰，博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要从事心血管疾病的临床诊治及生物标志物研究,Tel：010-66721250，Email：dr_shibing@bjmu.edu.cn

2015-05-04

: SHI Bing, ZHANG Tianyang, LIU Xingyu, et al. E ff ect of cigarette smoking on plasma microRNA expression pro fi le [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)