微波法提取连翘苷的工艺研究

胡英婕

（锦州医科大学 医疗学院，辽宁 锦州 121000）

微波法提取连翘苷的工艺研究

胡英婕

（锦州医科大学 医疗学院，辽宁 锦州 121000）

以连翘叶为原料，连翘苷含量为检测指标，以提取溶剂、液料比、微波功率、提取时间为因素，采用四因素三水平 L9（34）正交设计优选出连翘苷的最佳提取条件。结果表明，最佳提取条件为用液料比10∶1的75%乙醇微波（300 W）提取3次，每次120 S，得到连翘苷含量为0.52%。提取工艺合理可行，稳定可靠。

微波；连翘苷；提取工艺

连翘是中药临床常用药材之一，具有清热解毒，消肿散结、疏散风热之效，常取其果实用药，2015年版药典规定用高效液相色谱测定其主要成分连翘苷的含量。现代药理和化学成分研究表明，连翘叶具有与果实相似的化学成分，含连翘苷、连翘酯苷A、齐墩果酸、芦丁等多种有效成分，具有良好的抑菌、抗病毒作用，在治疗肺炎、上呼吸道感染等方面有很好的疗效［1-2］。

但 2015版药典尚未收录连翘叶做药材，本研究以连翘叶为研究对象，采用微波提取工艺，正交实验设计摸索出其主要成分连翘苷的最佳提取方案。目前文献没有用此方法提取连翘苷的报道，该提取工艺对促进连翘叶用药及连翘苷单体的开发和利用具有重要意义。

1 实验

1.1 试剂与仪器

连翘叶，采自辽宁中医药大学校园内，经锦州成大方圆药店主任中药师王景清鉴定为木犀科植物连翘的叶子。连翘苷对照品，购自中国药品生物制品检定所（批号：120520-201503）；甲醇、乙腈为色谱醇（天津市康科得科技有限公司），乙醇为国产分析纯，水为自制重蒸水。

BP211D 型十万分之一电子分析天平（德国 Satrorius 公司）、KQ-100A 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、NJL07-3型微波提取设备（南京杰全微波设备有限公司）、ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（北京金欧亚科技发展有限公司）。TU-1800 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。检测波长：用紫外检测器对连翘苷对照品溶液进行紫外全程扫描。连翘苷的最大吸收波长在 277 nm 处，故确定连翘苷的检测波长是 277 nm。F 2200型高效液相色谱仪（温岭福立分析仪器公司），流动相/乙腈―水（25∶75），柱温 35℃，检测波长 277 nm，体积流量 0.8 mL/min。

1.2 实验操作

连翘苷供试品溶液的制备 取连翘叶研成粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，用液料比为10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置微波提取器中，微波功率300 W，提取3次，每次120 s，摇匀，滤过，滤液即为供试品溶液。

连翘苷对照品储备液的配制 取 105℃干燥至恒重的连翘苷对照品 5.0 mg，置于 25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解、稀释至刻度，定容为含连翘苷0.2 mg/mL 的储备液。

2 结果与讨论

2.1 连翘苷的测定

标准曲线线性范围考察 精密吸取连翘苷对照品储备液 0.50、1.50、2.50、3.50、4.50、5.50、6.50 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后，各进样 10 μL， 注入高效液相色谱仪。记录连翘苷对照品的色谱图，由峰面积测定结果，得到进样量（x）和峰面积值（y）的回归方程：y=1 459 485 x+215 419.0，r=0.999 3。连翘苷进样量在0.1～1.3 g 范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度实验 精密吸取连翘苷对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，得到峰面积值，计算得到连翘苷含量的RSD=0.8%。

重复性实验 取同一批次样品制备成6份供试品溶液，分别进样10 μL，计算得到连翘苷含量的RSD =1.2%。

稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0、4、8、16、24 h进样，得到峰面积值。计算得到连翘苷含量的RSD=1.1%。表明供试品溶液在24 h之内稳定。

加样回收率实验 分别精密吸取一定量的供试品溶液，加入适量的对照品溶液，制备成加样供试品溶液，平行操作9次，得到峰面积值。计算得到平均回收率为98.85%，RSD=1.2%。

样品测定 精密吸取不同批次供试品溶液，进样6次，得到峰面积值。计算得到连翘苷含量的RSD= 1.3%。

2.2 连翘苷提取的单因素分析

根据相关文献［3-6］，考察单因素对连翘苷提取效果的影响。

2.2.1 提取溶剂的考察

表1是分别用50%乙醇、75%乙醇、纯水、50%甲醇、75%甲醇五种提取溶剂，得到的连翘苷含量，结果表明，提取溶剂对连翘苷的含量有影响，75%乙醇的提取效果较好。

表1 提取溶剂的考察结果

2.2.2 提取时间的考察

图1是每次提取时间分别为60、90、120、150、180 s，得到连翘苷含量的曲线图。由图1可知，提取时间对连翘苷的含量有影响，每次提取时间为120 s效果最好。

图1 提取时间对含量的影响

图2 液料比对含量的影响

2.2.3 液料比的考察

图2是液料比分别为8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1时，得到连翘苷含量的曲线图。由图2可知，液料比增加，连翘苷的得率也会增加。但液料比为10∶1、11∶1、12∶1得到的连翘苷含量无明显变化，考虑成本，选择最适宜液料比为10∶1。

2.2.4 微波功率的考察

图3是不同提取功率（200、300、400、500 W），得到连翘苷含量的曲线图。结果表明提取功率对连翘苷的含量有影响，功率为300 W效果较好。

图3 微波功率对含量的影响

图4是分别浸泡0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，得到连翘苷含量的曲线图。结果表明浸泡时间对连翘苷的含量有影响，浸泡时间为1h效果好些，浸泡时间过长，不仅后期过滤困难，提取效果反而不好。

图4 浸泡时间对含量的影响

2.2.6 原料粒度的考察

图5是药材粉碎分别过10目（1号筛）、24目（2号筛）、50目（3号筛）、65目（4号筛）、80目（5号筛），得到连翘苷含量的曲线图。结果：原料粒度对连翘苷的含量有影响，但50目（3号筛）、65目（4号筛）、80目（5号筛）测得连翘苷含量基本相同，而过65目（4号筛）和80目（5号筛），药材过碎，后期过滤增加难度，故选择过50目（3号筛）即可。

图5 原料粒度对含量的影响

2.2.7 提取次数的考察

图6是分别提取1、2、3、4次，得到连翘苷含量的曲线图。结果表明提取3次和提取4次，连翘苷含量相差不大，考虑成本，选择提取3次。

图6 提取次数对含量的影响

2.3 正交试验设计

(3)应该尽可能结合两汉时期某两组声母的语音关系来确定方言特点。语音发展是有传承性的。如果某两组声母混用仍集中表现在两汉时期某一特定方言区的作品中，则说明这一现象可能是某种方言特点的延续。具体而言，郭店楚简语音材料反映出的声母相近关系如果集中体现于两汉时期楚人的作品之中，则很可能说明这一特点即楚方言的声母特点。反之则非。

由单因素分析结果可知，提取溶剂、液料比、微波功率、提取时间均会对连翘苷含量有影响，设计正交实验四因素三水平表，如表2所示。

表2 连翘苷提取正交试验因素及水平表

取连翘叶研成粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，置微波提取器中，分别按照 L9（34）正交表设计提取方案进行 3 次重复试验，摇匀，滤过，即为供试品溶液。供试品溶液微孔滤膜过滤后，进样 10 μL，将峰面积值代入标准曲线回归方程，计算连翘苷含量，结果如表3所示。连翘苷提取结果方差分析表如表4所示。

表3 连翘苷提取 L9（34）正交实验结果表

续表3

表4 连翘苷提取结果方差分析表

以连翘苷含量为评价指标，由极差 R 值大小可知，各因素影响作用主次为：D＞C＞B＞A。方差分析结果表明：A、B、C、D 因素影响均较大，均具显著意义（P＜0.01）。根据正交实验结果，连翘苷最佳提取方案为：A3B3C2D1。即用液料比10∶1的75%乙醇微波（功率300 W）提取3次，每次120 s。

综上所述，连翘苷提取方案为：取连翘叶研成粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，用液料比为10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置微波提取器中，微波功率300 W，提取3次，每次120 s，摇匀，滤过，滤液即为供试品溶液。供试品溶液微孔滤膜过滤后，进样10 μL，峰面积带入标准曲线回归方程，计算连翘苷含量。

2.4 最佳工艺验证试验

取3批药材进行验证实验，得到连翘苷的含量分别为0.55%、0.53%、0.59%，表明本提取工艺稳定、可靠，且提取效果较好。

2.5 不同方法提取连翘苷工艺的比较

文献优选提取连翘叶中连翘苷的方法有超声提取和加热回流提取两种方法，和本实验优选的微波提取方法做比较。

2.5.1 超声提取法

取连翘叶研成粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，用液料比为10∶1的水浸泡1 h，置锥形瓶中超声提取3次，每次30 min，过滤。再微孔滤膜过滤后，进样，计算得到连翘苷的含量为4.77%。

2.5.2 加热回流提取

取连翘叶研成粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，用液料比为10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置烧瓶中回流提取3次，每次提取30 min，过滤。再微孔滤膜过滤后，进样，计算得到连翘苷的含量为4.86%。

2.5.3 微波提取法

取连翘叶研成粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，用液料比为10∶1的75%乙醇浸泡1 h，置微波提取器中，微波功率300 W，提取3次，每次120 s，摇匀，滤过，滤液即为供试品溶液。供试品溶液微孔滤膜过滤后，进样10 μL，将峰面积值带入标准曲线回归方程，计算连翘苷含量为0.54%。

结果表明：微波提取法所得到的连翘苷含量高，且提取时间短，安全节能。由于药典还没有把连翘叶收录为药材，没有连翘苷含量的准确数据，故所测得含量值越大，表明提取效果越好。

3 结论

1）微波提取优点是对提取物具有较高的选择性，提取率高，提取速度快，溶剂用量少，安全节能，设备简单，为现代中药材提取的先进方法。

2）连翘苷经最佳工艺提取后，用高效液相色谱测定连翘苷的含量。实验色谱条件下，在其对照品出峰保留时间处，有相应色谱峰，且连翘苷峰与杂质峰较好分离，连翘苷峰理论塔板数不低于4 000，分离度＞1.5。

3）由连翘苷含量结果知，连翘叶中所含连翘苷的含量比连翘高3倍以上，且含有连翘酯苷A、齐墩果酸、芦丁等其他有效成分，进一步寻找这些成分的提取纯化方法，会为将来连翘叶用药提供更有力的理论依据。

［1］ 原江峰, 王大红, 何灵美, 等. 连翘叶提取物抑菌作用以及稳定性研究［J］. 食品工业科技, 2013, 34（5）: 57-59.

［2］ 秦臻, 徐军, 张立伟. 连翘及连翘叶体外抑菌作用研究［J］. 食品工程, 2013, 6（2）: 49-52.

［3］ 李飞鹤, 杜杰, 陈廷贵, 等. 连翘苷快速提取纯化工艺研究［J］. 食品工程, 2014, 4（2）: 32-35.

［4］ 姬雪礼, 李文烈, 郑晓杰, 等. 高效液相色谱法同时测定连翘叶中连翘酯苷A和连翘苷含量［J］. 中国药业, 2014, 23（7）: 33-34.

［5］ 杨隶华, 黄兰, 郑显辉, 等. 不同产地连翘叶中连翘苷和连翘酯苷A的含量测定［J］. 临床医学工程, 2013, 20（3）: 288-289.

［6］ 欧阳丽娜, 李兰林, 吴雪, 等. 正交设计优选竹节参总皂苷微波提取工艺的研究［J］. 中草药, 2010, 41（10）: 1639-1642.

Investigation on Microwave Extraction Technology of Phillyrin

HU Ying-jie
（Medical College, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China）

The extraction process was optimized by L9（34） orthogonal test with forsythia suspense leaves as material, the content of phillyrin as detect index, and extraction solvent, liquid to material ratio, microwave power and extraction time as influential factors. The optimal extraction conditions was microwave （300 W） extracting 3 times by 75% ethyl alcohol （liquid material ratio 10∶1）, 120 S. The content of phillyrin was 0.52%. The optimal extraction process was steady and reliable.

microwave； phillyrin； extraction technology

R284.2

A

1009-220X（2016）05-0007-06

10.16560/j.cnki.gzhx.20160515

2016-06-30

胡英婕（1971～），女，讲师，硕士；主要从事药物有效成分的化学分析的研究。jzykdxylxyhyj@126.com