PITC柱前衍生-反相高效液相色谱法测定黄酒中游离氨基酸和生物胺

芮鸿飞，张晓瑜，刘兴泉*，吴峰华，王卓然，李凯利

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300）

PITC柱前衍生-反相高效液相色谱法测定黄酒中游离氨基酸和生物胺

芮鸿飞，张晓瑜，刘兴泉*，吴峰华，王卓然，李凯利

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300）

建立柱前衍生-反相高效液相色谱，同时测定黄酒中17 种氨基酸及7 种生物胺含量的方法。采用异硫氰酸苯酯柱前衍生试剂，采用Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析，以乙酸钠溶液和乙腈溶液混合液进行梯度洗脱，在254 nm波长处进行氨基酸和生物胺的含量分析。氨基酸和生物胺在2.0～500 mg/L和0.5～125 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数R2大于0.99，平均回收率在86.44%～99.75%之间，相对标准偏差在0.31%～3.53%之间；检出限为0.02～0.25 mg/L，定量限为0.25～4.50 mg/L。方法线性范围广、准确性高、稳定性好，适用于黄酒中氨基酸及生物胺的检测。

黄酒；氨基酸；生物胺；反相高效液相色谱

芮鸿飞， 张晓瑜， 刘兴泉， 等. PITC柱前衍生-反相高效液相色谱法测定黄酒中游离氨基酸和生物胺［J］. 食品科学， 2016，37（8）: 159-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608028. http://www.spkx.net.cn

RUI Hongfei， ZHANG Xiaoyu， LIU Xingquan， et al. Simultaneous determination of free amino acids and biogenic amines in chinese rice wine by RP-HPLC with pre-column phenylisothiocyanate （PITC） derivatization［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 159-163. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608028. http://www.spkx.net.cn

黄酒是世界上最古老的酿造酒之一，因其营养丰富、酒性温和、酒度较低、价格适中成为带有民族传统特定的大众饮料酒。黄酒中氨基酸含量丰富，被称为“液体蛋糕”，氨基酸不仅是黄酒主要营养成分之一，也是酒的风味物质和风味物质的前驱［1-2］。黄酒中的游离氨基酸可以进行脱羧基生成相应的生物胺［3］。生物胺是一类具有生物活性的低分子含氮化合物的总称，当人体摄入过量会引起头痛、恶心、呼吸紊乱等反应，严重时还会危及生命［4-5］。张敬等［6］调查研究表明黄酒中生物胺含量在18.6～140.0 mg/L，平均含量为78.3 mg/L，远高于葡萄酒和啤酒中生物胺的含量，因此，生物胺成为黄酒中的一种潜在的风险物质。

目前，氨基酸的测定方法有显色法、氨基酸自动分析仪、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等［6］；生物胺的分析方法已经报道的有高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫法等［7］。氨基酸和生物胺的分析方法以高效液相色谱法最为常见，原理是氨基酸和生物胺的衍生物可以通过在某些检测器下的响应值来定性定量。常用的衍生剂有异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、丹磺酰氯（dimethylaminonaphthalene sul-fonyl chloride，Dansyl-Cl）、邻苯二甲醛（1，2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）、氯甲酸芴甲酯、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯等［8-13］。美国分析化学家协会官方以茚三酮为柱后衍生试剂的高效液相色谱-紫外检测法作为分析氨基酸的标准方法，该方法准确、可靠、重复性好，但灵敏度不高。OPA代替茚三酮做为柱后衍生试剂，采用荧光检测，灵敏度提高了3个数量级，但其不能与二级氨基酸（氨基为仲氨基，如脯氨酸）反应。Dansyl-Cl能与氨基酸和生物胺的一级氨基（伯氨基）和二级氨基（仲氨基）都能反应，但反应较慢，且过多的衍生剂会对测定结果。以PITC为柱前衍生剂的氨基酸分析方法以其反应速度快、产物单一稳定，与一级、二级氨基均可反应等特点，在紫外检测器下，有较高的灵敏度，且柱前衍生相对柱后衍生，有省时、仪器配置简单的优势，因而得到广泛的应用［14］。

国外已有同时分析氨基酸和生物胺的方法研究［15-19］，并应用于氨基酸和生物胺的发酵过程研究中，国内鲜见报道。本实验以PITC为柱前衍生剂，采用反相高效液相色谱法同时测定黄酒中17 种游离氨基酸及7 种生物胺含量，以期为黄酒检测中多种氨基酸和生物胺的检测提供简便实用的方法。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

8 种黄酒 市售。

异硫氰酸苯酯（纯度＞98%）、17 种氨基酸（纯度＞98%）、7 种生物胺（纯度＞99.5%） 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯） 美国Tedia公司；乙酸钠（分析纯） 杭州化学试剂有限公司；1.2% PITC-乙腈溶液：准确移取1.2 mL异硫氰酸苯酯溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度；14%三乙胺-乙腈溶液：准确移取14 mL三乙胺至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度；0.1 mol/L乙酸钠缓冲液：准确称取三水合乙酸钠13.61 g，加水溶解后加入5 mL三乙胺，并用水定容至1.0 L，用0.1 mol/L乙酸调pH值至6.2。

LC-20AT液相色谱（配二极管阵列检测器和自动进量器） 日本岛津公司；QZ-866旋涡振荡器、GL-3250A磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PSC30U-120分析天平、FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器公司；TDL-40B离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2方法

1.2.1标准工作溶液的配制

分别称取氨基酸12.50 mg、生物胺6.25 mg，用0.1 mol/L盐酸定容至25 mL的容量瓶中，超声至完全溶解，得（0.5+0.25） mg/mL的氨基酸-生物胺混合标准溶液，4 ℃保存。用0.1 mol/L盐酸将混合标准稀释成质量浓度为（500+250）、（250+125）、（50+25）、（10+5.0）、（2.0+1.0） mg/L的混合标准系列梯度溶液，待衍生化操作。

1.2.2量品衍生化

准确移取1 mL量液于10 mL具塞试管中，分别加入14%三乙胺-乙腈溶液和1.2%异硫氰酸苯酯-乙腈溶液各0.5 mL，混匀，室温条件下静置30 min后，加入2 mL正己烷，旋涡混合器振荡60 s后静置10 min，萃取反应过剩的PITC，取下层清液经0.45 µm有机滤膜过滤后待反相高效液相色谱分析。

1.2.3色谱条件

色谱柱：C18Inertsil ODS-SP色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.1mol/L乙酸钠缓冲液-乙腈（97∶3，V/V）；流动相B：乙腈-水（4∶1，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进量量：10 μL；洗脱程序见表1。

表1　分析梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3数据处理

采用Excel、SPSS 19.0软件进行数据统计分析。每组平行3 次，测定结果以平均值表示。

2　结果与分析

2.1氨基酸、生物胺的定性

采对0.02 mol/L乙酸钠-乙腈［15］、磷酸盐缓冲液［16］、醋酸钠缓冲溶液（pH 6.5）-乙腈溶液［20～22］、0.1 mol/L乙酸钠-乙腈-水［23］等流速相分别进行实验，结果显示0.1 mol/L乙酸钠-乙腈-水分离效果最好，且流动相中加入0.5%的三乙胺溶液，pH值调至6.2时分离效果更好。在保证分离的条件下，将流动性梯度洗脱程序进行调整，得出最佳分离条件，结果见表1，在此条件下17 种氨基酸和7 种生物胺实现了基线分离，各氨基酸和生物胺之间无干扰，标准色谱图如图1所示，17 种氨基酸和7 种生物胺在55 min内全部出峰，相比其他研究者报道［14，24］的方法更节省时间；黄酒量品色谱图如图2所示，酒中其他物质对氨基酸和生物胺的衍生物检测出峰无干扰，本方法适用于黄酒中氨基酸和生物胺的分析。

图1　氨基酸和生物胺标准色谱图Fig.1 Chromatogram of amino acid and biogenic amine standards

图2　黄酒样品中氨基酸和生物胺色谱图Fig.2 Chromatograms of amino acids and biogenic amines in Chinese rice wine

2.2衍生条件的确定

考察15、25、35 ℃ 3 个温度对衍生化反应的影响，结果显示温度对衍生结果影响不显著（P＞0.05），因此选择室温条件下进行；考察0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、 2.0%等不同质量分数的PITC-乙腈溶液对衍生化反应的影响；当PITC质量分数超过1.2%之后，结果差异不显著；因此选用质量分数为1.2%的PITC-乙腈溶液作为量品衍生时的衍生剂。考察10、20、30、40、50 min等不同衍生时间对衍生反应的影响；30 min后结果差异不显著，因此选用30 min作为量品的衍生时间。最终衍生确定在室温条件下进行，衍生剂质量分数为1.2%的PITC-乙腈溶液，反应30 min。

2.3标准曲线和检出限测定结果

以标准系列梯度溶液质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性范围；将加标量品逐渐稀释后衍生后进量，以RSN不小于3计算得该方法的检出限，以RSN不小于10计算得该方法定量限，结果见表2。检出限为0.02～0.25 mg/L，定量限为0.25～4.50 mg/L。

表2　氨基酸和生物胺的线性回归方程Table 2 Linear regression equations of amino acids and biogenic amines

2.4回收率和精密度实验结果

根据本实验方法，对黄酒量品进行3 水平（半量、等量、倍量）的加标实验，平行测定6 次，结果见表3。得平均加标回收率在86.44%～99.75%之间，相对标准偏差在0.31%～3.53%（n=6）之间，可以满足黄酒中氨基酸含量测定的要求。

表3　黄酒中氨基酸和生物胺的回收率、相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of amino acids and biogenic amines in Chinese rice wine （n= 6）

2.5量品测定结果

表4　黄酒中氨基酸和生物胺含量Table 4 Contents of 17 amino acids and 7 biogenic amines of Chinese rice wine mg/L

本实验选用8 种不同品种的黄酒进行分析，包括甜型（量1、量2、量3）、半干（量4、量5）和干型（量6、量7、量8）3 种含糖量不同的黄酒，结果见表4。

由表4可知，本实验测定8 种黄酒中，氨基酸含量与生物胺含量因黄酒品种的不同而各有差异［9，14-15］，氨基酸含量在1 433.49～2 730.69 mg/L之间，平均值为2 156.00 mg/L；生物胺含量在39.49～67.48 mg/L之间；其中生物胺以色胺、腐胺和酪胺较多，但在安全范围内，对黄酒安全无影响，与张凤杰等［25］结果一致。

3　结 论

本实验成功采用反相高效液相色谱法建立了一种有效地同时测定黄酒种17 种氨基酸及7 种生物胺含量的方法，实现了17 种氨基酸和7 种生物胺的基线分离，方法专属性好，各氨基酸和生物胺之间无干扰。对市售8 种不同种类的黄酒中游离氨基酸和生物胺进行了实际量品检测，测试的3 种类型黄酒均适用本方法，酒中其他物质对氨基酸和生物胺的衍生物出峰无干扰。实验结果为黄酒中多种氨基酸和生物胺的同时测定提供了简便、实用的方法。

［1］ 李博斌， 李祖光， 刘兴泉， 等. 黄酒风味物质与黄酒香气感官评分的定量关系［J］. 酿酒科技， 2008（11）: 90-92； 96. DOI:10.13746/ j.njkj.2008.11.029.

［2］ 诸葛庆， 李博斌， 刘兴泉， 等. 用离子色谱法分析研究黄酒中的氨基酸［J］. 酿酒科技， 2008（4）: 108-111. DOI:10.13746/j.njkj.2008.04.029.

［3］ 李家寿. 黄酒色、香、味成分来源浅析［J］. 酿酒科技， 2001（3）: 48-50. DOI:10.13746/j.njkj.2001.03.022.

［4］ 李志军， 吴永宁， 薛长湖. 生物胺与食品安全［J］. 食品与发酵工业，2004， 30（10）: 84-91. DOI:10.13995/j.Cnki.11-1802/ts.2004.10.019.

［5］ 刘景， 任婧， 孙克杰. 食品中生物胺的安全性研究进展［J］. 食品科学，2013， 34（5）: 322-326.

［6］ 张敬， 赵树欣， 薛洁， 等. 发酵型饮料酒中生物胺含量的调查与分析［J］. 食品与发酵工业， 2012， 38（6）: 165-170. DOI:10.13995/ j.cnki.11-1802/ts.2012.06.037.

［7］ 陆永梅， 董明盛， 吕欣， 等. 高效液相色谱法测定黄酒中生物胺的含量［J］. 食品科学， 2006， 27（1）: 196-199. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2006.01.046.

［8］ ONAL A， TEKKELI S E K， ONAL C. A review of the liquid chromatographic methods for the determination of biogenic amines in foods［J］. Food Chemistry， 2012， 138（1）: 509-524. DOI:10.1016/ j.foodchem.2012.10.056.

［9］ LU Yongmei， LU Xin， CHEN Xiaohong， et al. A survey of biogenic amines in Chinese rice wines［J］. Food Chemistry， 2007， 100（4）: 1424-1428. DOI:10.1016/j.foodchem.2005.11.035.

［10］ ARRIET M P， PRATS-MOTA M S. Free amino acids and biogenic amines in Alicante Monastrell wines［J］. Food Chemistry， 2012，135（3）: 1511-1519. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.06.008.

［11］ BUSTO O， VALERO Y， GUASCH J， et al. Solid phase extraction applied to the determination of biogenic amines in wines by HPLC［J］. Chromatographia， 1994， 38（9）: 571-578. DOI:10.1007/BF02277156.

［12］ BUSTO O， MESTRES M， GUASCH J， et al. Determination of biogenic amines in wine after clean-up by solid-phase extraction［J］. Chromatographia， 1995， 40（7）: 404-410. DOI:10.1007/BF02269903.

［13］ 邢健， 李巧玲， 耿涛华， 等. 氨基酸分析方法的研究进展［J］.中国食品添加剂， 2012， 23（5）: 187-191. DOI:10.3321/ j.issn:0253-3820.2005.03.028.

［14］ 崔泓， 张尧， 周东升. 柱前衍生-HPLC法测定黄酒中氨基酸［J］. 中国卫生检验杂志， 2014， 24（8）: 1082-1084.

［15］ 钟其顶， 高红波， 熊正河， 等. PITC柱前衍生高效液相色谱法测定黄酒中17 种氨基酸方法研究［J］. 酿酒， 2010， 37（5）: 74-76. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2010.05.028.

［16］ MARINA P A， MARIA A P M. Free amino acids and biogenic amines in Alicante Monastrell wines［J］. Food Chemistry， 2012， 135（3）: 1511-1519. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.06.008.

［17］ HERBERT P， ABRITA M J， RATOLA N， et al. Free amino acids and biogenic amines in wines and musts from the Alentejo region. Evolution of amines during alcoholic fermentation and relationship with variety， sub-region and vintage［J］. Journal of Food Engineering，2004， 66（3）: 315-322. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2004.03.024.

［18］ KELLY M T， BLAISE A， LARROQUE M. Rapid automated high performance liquid chromatography method for simultaneous determination of amino acids and biogenic amines in wine， fruit and honey［J］. Journal of Chromatography A， 2010， 1217（47）: 7385-7392. DOI:10.1016/j.chroma.2010.09.047.

［19］ CARLO I G T， FRANCESCA C， GABRIELE S， et al. Determination of dansylated amino acids and biogenic amines in Cannonau and Vermentino wines by HPLC-FLD［J］. Food Chemistry， 2015， 175（5）: 29-35. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.11.120.

［20］ WANG Yaqin， YE Dongqing， ZHU Baoqing， et al. Rapid HPLC analysis of amino acids and biogenic amines in wines during fermentation and evaluation of matrix effect［J］. Food Chemistry， 2014，163（4）: 6-15. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.04.064.

［21］ CANAS P M I， ROMERO E G， ALONSO S G， et al. Amino acids and biogenic amines during spontaneous malolactic fermentation in Tempranillo red wines［J］. Journal of Food Composition and Analysis，2007， 21（8）: 731-735. DOI:10.1016/j.jfca.2007.11.002.

［22］ 杨彬， 阮长春， 刘志， 等. 柱前衍生-反相高效液相色谱法测定柞蚕蛹蜕中氨基酸［J］. 食品科学， 2010， 31（16）: 213-216.

［23］ 杨菁， 孙黎光， 白秀珍， 等. 异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法同时测定18 种氨基酸［J］. 色谱， 2002， 20（4）: 369-371. DOI:10.3321/j.issn:1000-8713.2002.04.022.

［24］ 李国辉， 钟其顶， 高红波， 等. GC-FID测定黄酒中17 种游离氨基酸［J］. 食品与发酵工业， 2012， 38（12）: 147-151. DOI:10.13995/ j.cnki.11-1802/ts.2012.12.007.

［25］ 张凤杰， 薛洁， 王异静， 等. 黄酒中生物胺的形成及其影响因素［J］.食品与发酵工业， 2013， 39（2）: 62-68. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ ts.2013.02.035.

Simultaneous Determination of Free Amino Acids and Biogenic Amines in Chinese Rice Wine by RP-HPLC with Pre-Column Phenylisothiocyanate （PITC） Derivatization

RUI Hongfei， ZHANG Xiaoyu， LIU Xingquan*， WU Fenghua， WANG Zhuoran， LI Kaili
（School of Agriculture and Food Science， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China）

A reversed-phase high performance liquid chromatographic （RP-HPLC） method has been presented for the simultaneous determination of 17 free amino acids and 7 biogenic amines in Chinese rice wine. Wine samples were precolumn derivatized with phenylisothiocyanate （PITC）， separated using Inertsil ODS-SP C18chromatography column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）， eluted with a mobile phase composed of sodium acetate， acetonitrile and ultra-pure water， and detected at 254 nm. The calibration curves of 17 amino acids and 7 biogenic amines all exhibited good linearity over the range from 2.0 to 500 mg/L and 0.5 to 125 mg/L， respectively. Mean recoveries for amino acids and biogenic amines were between 86.44% and 99.75%， and the relative standard deviations （RSDs） were in the range of 0.31%-3.53%. The limits of detection （LODs）for 17 free amino acids and 7 biogenic amines were in the range of 0.02-0.25 mg/L， and the limits of quantification （LOQs）were 0.25-4.50 mg/L. The method is stable， accurate， and suitable for the simultaneous determination of amino acids and biogenic amines in Chinese rice wine， having a wide linear range.

Chinese wice wine； amino acids； biogenic amines； reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC）

10.7506/spkx1002-6630-201608028

TS262.4

A

1002-6630（2016）08-0159-05

2015-06-12

绍兴市重点科研项目（2014A22002）

芮鸿飞（1991—），男，硕士研究生，研究方向为食品分析与检测。E-mail：782546847@qq.com

刘兴泉（1973—），男，副教授，博士，研究方向为黄酒质量控制与食品安全。E-mail：liuxq@zafu.edu.cn

引文格式：