石榴皮木醋液的化学成分及抗氧化活性

张立华，孙凤杰，赵文亚，郑丹丹，王京龙

（枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 277160）

石榴皮木醋液的化学成分及抗氧化活性

张立华，孙凤杰，赵文亚，郑丹丹，王京龙

（枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 277160）

为探索石榴皮资源利用的新途径，以石榴皮为原料经干馏（350～500 ℃）制备了木醋液，并采用气相色谱-质谱联用仪分析其化学成分，通过对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羟自由基清除实验评价其抗氧化活性。结果显示，石榴皮木醋液的总酚、总酮和有机酸含量分别为10.92、7.81 mg/mL和2.53%；共检测出27 种有机化合物，包括酚类、有机酸、醇类、烷烃、醛类及酮类化合物等。石榴皮木醋液对DPPH自由基和羟自由基清除力的VC当量分别为10.22 µg/mg和45.19 µg/mg。结果表明，石榴皮木醋液可作为一种天然抗氧化剂资源，具有一定的开发利用价值。

石榴皮；木醋液；化学成分；抗氧化活性

张立华， 孙凤杰， 赵文亚， 等. 石榴皮木醋液的化学成分及抗氧化活性［J］. 食品科学， 2016， 37（8）: 127-130. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201608022. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lihua， SUN Fengjie， ZHAO Wenya， et al. Chemical constituents and antioxidant activities of wood vinegar from pomegranate husk［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 127-130. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608022. http://www.spkx.net.cn

木醋液，也叫植物酸，泛指农林加工剩余物、废弃物等生物质干馏过程中的气体混合物经冷凝分离后得到的液体产物［1］。木醋液中主要成分是水，含量为80%～90%，其次是有机酸、酚类、醇类和酮类等物质［2-3］。木醋液有很多用途，可以作为除臭剂、消毒剂、食品添加剂、植物生长促进剂、土壤改良剂、医药和农药等的原料［4-6］。在美国、日本、韩国等国家的农业中均获得推广应用，在美国木醋液主要用在花园园艺，在日本每年大约生产4 000万 L的木醋液，其中一半应用于农业生产［7-9］。而在我国木醋液的研究起步较晚，应用还不够广泛。

石榴皮是石榴（Punica granatum L.）的果皮，占石榴果实的20%～30%，富含多酚、类黄酮等活性物质［10］，具有显著的抑菌、抗癌、抗病毒、抗氧化等作用［11-12］。但目前石榴皮还没被充分利用，大都被废弃，不仅污染环境，还造成资源浪费。对石榴皮资源利用的研究多涉及以石榴皮为原料提取单宁、安石榴苷、鞣花酸及黄酮等［13-14］。有关石榴皮木醋液方面鲜见报道。本实验分析了石榴皮木醋液的化学成分及抗氧化活性，以期为石榴皮资源的开发利用开辟新的途径。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

石榴皮，即成熟石榴的果皮，产地为山东省枣庄峄城石榴园向阳山坡薄地，品种为大青皮石榴，树龄为20 a。使用鼓风干燥箱在80 ℃条件下烘干。

邻二苯酚、甲基环戊烯醇酮标准品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美国Sigma公司；Folin-酚试剂、抗坏血酸、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、氢氧化钾、无水乙醚、无水硫酸钠等均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

UV-2000型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；干馏釜 南京林业大学林产化工学院；7000B气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪 美国Agilent公司。

1.3方法

1.3.1石榴皮木醋液的制取

［15］中的方法，将烘干石榴皮粉碎成约0.3 cm粒径的颗粒，然后将石榴皮颗粒放入干馏釜中，以1 kW的功率持续加热，温度控制在350～500 ℃范围，在冷凝装置中通入冷水，冷凝干馏时产生的气体，收集馏出液，静置30 d，木醋液分离为3 层，上层为少量油状物，中层为澄清液，底层为黏稠的木焦油等杂质。用虹吸法取中层的澄清液，并与5%的活性炭粉末混合，搅拌10 min，静置3 d，过滤得精制石榴皮木醋液。

1.3.2总酚含量测定

取精制的石榴皮木醋液用蒸馏水稀释200 倍，然后采用Folin酚法［16］测定其总酚含量，以邻苯二酚为标准品。

1.3.3总酮含量测定

取精制的石榴皮木醋液用蒸馏水稀释20 倍，然后采用Al（NO3）3-NaNO2比色法［17］测定总酮含量，以甲基环戊烯醇酮为标准品。

1.3.4有机酸含量测定

采用酸碱电位滴定法［3］，有机酸总量以醋酸质量分数计。

1.3.5石榴皮木醋液的有机成分分析

1.3.5.1石榴皮木醋液的预处理

参照文献［18］中的方法预处理石榴皮木醋液，取精制木醋液30 mL，每次用10 mL乙醚，萃取6 次，合并乙醚萃取液，加入2.0 g无水硫酸钠吸收其中的水分，过滤后使用旋转蒸发仪回收乙醚，萃取液浓缩至3 mL，用作GC-MS待测量品。

1.3.5.2GC-MS测定

参照文献［18］中直接进量法对石榴皮木醋液萃取浓缩液成分用GC-MS法进行分析。

1.3.5.3GC条件

DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进量口温度220 ℃；升温程序：柱温60 ℃，恒温2 min后，以6.0 ℃/min速率升温至240 ℃，恒温8 min；分流进量80∶1；载气流速1.0 mL/min。

1.3.5.4MS条件

电子电离源；电子能量70 eV；质量扫描范围35～400 u，质谱标准库NIST 11。

1.3.6羟自由基（·OH）清除率的测定

参照文献［19］方法，反应体系体积为5 mL，其中含0.15 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4），114 μmol/L番红花，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）-Fe2+（1 mmol/L硫酸亚铁含2 mmol/L EDTA-Na2），3% H2O2（新鲜配制）以及不同质量浓度的量品；以蒸馏水代替量品作为量品空白，37 ℃水浴反应30 min，以0.3 mol/L EDTA-Na2终止反应，于波长520 nm处测定光吸光度，以去离子水代替量品和FeSO4的用量为对照。按公式（1）计算·OH清除率。

式中：A量品空白为不含量品的空白吸光度；A量品为量品吸光度；A对照为不含量品和FeSO4的对照的吸光度。

绘制量品不同用量条件下清除率曲线，求出清除率为50%时的浓度，即半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

以质量浓度20 µg/mL的VC为参照，按上述步骤操作并求出IC50，通过比较二者的IC50值计算出量品的VC当量（µg/mg）。

1.3.7DPPH自由基清除率的测定

参照文献［20］的方法并加以改进，操作方法为：向3 mL吸光度为1.5的DPPH自由基-甲醇溶液中加入一定量的试量（空白对照用等量重蒸水代替），总体积用蒸馏水补充至4 mL用力摇匀后于室温条件下放置30 min，再用光径1 cm比色皿测定DPPH自由基混合溶液在波长517 nm处吸光度（A517nm），用2.5 mL甲醇与0.5 mL试量混合液调仪器零点，以扣除试量本身颜色的影响。按公式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白对照吸光度；A量品为量品的吸光度。

并绘制量品不同用量条件下清除率曲线，求出其IC50。以质量浓度20 µg/mL的VC为参照，按上述步骤操作并求出IC50，通过比较二者的IC50值计算出量品的VC当量（µg/mg）。

2　结果与分析

2.1石榴皮木醋液的制取率及其总酚、总酮及有机酸含量

按照1.3.1节中的方法多次制取石榴皮木醋液，获得粗制木醋液的得率平均为24.5%，精制木醋液的得率平均为16.3%，经测定精制木醋液中可溶性固形物含量为6.4%，其余93.6%为水分。经测定，石榴皮木醋液中总酚含量为10.92 mg/mL，总酮含量为7.81 mg/mL，有机酸占体积分数的2.53%。有报道［3］工业品木醋液中有机酸占到5.13%，核桃壳木醋液中有机酸含量最高为6.31%［21］，杜仲叶林枝木醋液中有机酸含量最高达13.38%［22］。可见，本实验所制石榴皮木醋液有机酸含量相对较低。

2.2有机成分分析

图1　石榴皮木醋液GC-MS总离子质谱图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of wood vinegar from pomegranate husk

将石榴皮木醋液按1.3.5节所述方法处理，并按所述条件进行GC-MS分析，所得质谱见图1，根据NIST数据库检索和人工解析等方法确定物质种类。共鉴定出27 种物质，见表1。主要有酚类、有机酸、醇类、烷烃、醛类及酮类化合物等。其中酚类有9 种，苯酚、麦芽酚、2，4-二甲苯酚、2-乙基苯酚、甲氧甲酚、邻苯二酚、2，6-二叔丁基对甲酚、2，6-二甲氧基苯酚、2，4-二枯基酚。有机酸有乙酸、3-癸烯酸和10-十一碳炔酸3 种。醇类有6 种，分别为3-羟基-苯乙醇、5-异丙烯基-2-甲基-环氧环己烷-2-醇、木焦油醇、对二甲氧基苯甲醇、2-甲基十六醇、叔十六硫醇。烷烃类有5 种，分别为3，4，5-三甲氧基甲苯、三十五烷、1，54-二溴五十四烷、二十九烷和二十五烷。醛类有5-甲基-2-呋喃羧酸醛和5-羟甲基糠醛2 种。酮类有4-羟基-3-甲氧基苯丙酮。还有1 种含N杂环化合物1-乙酰咪唑。

表1　石榴皮木醋液的主要化学成分Table 1 Chemical constituents of wood vinegar from pomegranate husk

2.3对·OH及DPPH自由基的清除能力

表2　石榴皮木醋液对·OH及DPPH自由基的清除结果Table 2 Scavenging activities of pomegranate husk wood vinegar against hydroxyl and DPPH free radicals

由表2可知，在相同的反应体系中VC对·OH及DPPH自由基的IC50分别为0.17 mg/mL和0.39 mg/mL，石榴皮木醋液对2 种自由基的IC50分别为16.67 mg/mL和8.63 mg/mL；对·OH的清除能力石榴皮木醋液相当于VC的量，即VC当量为10.22 µg/mg，对DPPH自由基的清除能力石榴皮木醋液的VC当量为45.19 µg/mg。单从数据上看，石榴皮木醋液对2 种自由基的清除能力明显低于抗氧化剂VC，可石榴皮木醋液中水的比例在90%以上，因此，仍能说明石榴皮木醋液具有较强的体外抗氧化活性。

3　讨论与结论

经常规化学分析的方法测定出石榴皮木醋液中总酚含量为10.92 mg/mL、总酮含量为7.81 mg/mL、有机酸含量占体积分数的2.53%。与其他类型的木醋液相比，有机酸的含量较低，核桃壳木醋液中有机酸含量最高为6.31%［21］，杜仲叶林枝木醋液中有机酸含量最高达13.38%［22］，这可能与制取木醋液的原料有关，原料不同有机酸含量差异较大。另外，制作木醋液的温度对有机酸含量也有显著影响，温度越高木醋液中有机酸含量越低［21］，本实验所选温度在350～500 ℃范围内，温度相对较高。

进一步通过GC-MS分析其成分，共检出27 种化合物，其中最多的是酚类化合物有9 种成分，其次为醇类和烷烃化合物，分别为6 种和5 种，此外，还有3 种有机酸、2 种醛，酮和杂环化合物各1 种。毛巧芝等［23］在170～370 ℃温度段苦杏壳木醋液中检出化合物27 种，王元等［21］在90～190、190～300 ℃及300～480 ℃3 个温度段的核桃壳木醋液中分别检出13、42 种和37 种物质。对比分析，不同植物材料的木醋液中化合物的类别基本相同，主要是酸类、酚类、醛类、酮类、醇类等，还有少数呋喃和酯类物质。不同植物材料、不同干馏工艺会影响所制木醋液的化学成分，并且差别明显。

通过测定石榴皮木醋液对·OH及DPPH自由基的清除能力评价其抗氧化活性，实验结果表明石榴皮木醋液具有较强的抗氧化活性，这与石榴皮木醋液含有多种酚类物质有关，通常认为酚类物质是一类强抗氧化剂。其中，石榴皮木醋液中所含的2，6-二叔丁基对甲酚就是一种被用作抗氧化剂的食品添加剂。因此，石榴皮木醋液可以作为进一步制取抗氧化剂的原料。

综上所述，石榴皮木醋液所含化学成分比较丰富，具有较强的抗氧化活性，开发利用，变废为宝，提高石榴资源生物利用度。

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Chemical Constituents and Antioxidant Activities of Wood Vinegar from Pomegranate Husk

ZHANG Lihua， SUN Fengjie， ZHAO Wenya， ZHENG Dandan， WANG Jinglong
（College of Life Sciences， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160， China）

In order to explore a new approach to the utilization of pomegranate husk， wood vinegar was prepared by pyrolyzing pomegranate husk in the temperature range of 150-400 ℃. Chemical constituents of the wood vinegar were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Its antioxidant activities were evaluated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical and hydroxyl radical scavenging methods. The results showed that the contents of total phenols， total ketones and organic acid in the wood vinegar were 10.92 mg/mL， 7.81 mg/mL and 2.53% respectively. A total of 27 compounds were detected by GC-MS analysis from the wood vinegar， mainly including phenols， organic acids，alcohols， alkanes， aldehydes and ketones. Its scavenging activities against DPPH and OH hydroxyl radicals were 10.22 µg/mg and 45.19 µg/mg VC equivalent， respectively. This study suggested that wood vinegar from pomegranate husk has the potential to be used as a natural antioxidant resource.

pomegranate husk； wood vinegar； chemical constituents； antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201608022

S482.2

A

1002-6630（2016）08-0127-04

2015-08-18

山东省自然科学基金项目（ZR2013BL018）；山东农业大学作物生物学国家重点实验室开放基金项目（2014KF09）

张立华（1969—），男，教授，博士，研究方向为植物资源开发及采后生理。E-mail：chinazhanglh@163.com

引文格式：