芪参益气滴丸对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸转运体及谷氨酰胺合成酶表达的影响

罗　钢　蔡丽英

(黄石市中心医院，黄石，435000)



芪参益气滴丸对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸转运体及谷氨酰胺合成酶表达的影响

罗钢蔡丽英

(黄石市中心医院，黄石，435000)

目的：探讨芪参益气滴丸对糖尿病大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶及谷氨酸转运体的表达水平的影响。方法：选择维通利华实验动物研究所提供的六周龄SPF级SD大鼠80只，体重180～220 g，雄性，根据随机数字表法分为实验组(例数=70)、正常组(例数=10)，进行链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，一次性注射腹腔对胰岛β细胞进行选择性破坏，诱发实验性糖尿病；应用时由PH 4.4、0.1 mmol/L无菌的柠檬酸钠缓冲液配制为1% STZ溶液，根据大鼠体重予以65 mg/kg左下腹腔一次性注射1% STZ，正常组注射相同体积的生理盐水，72 h后应用快速血糖仪检测血糖水平；血糖水平超过16.7 mmol/L者则为糖尿病大鼠模型；随机分为对照组(多贝斯对照组)(20只)、治疗组(芪参益气滴丸组)(30只)、糖尿病模型组(模型组)(20只)、正常组(例数=10)，应用RT-PCR法检测4组大鼠视网膜GFAP mRNA表达水平；应用免疫组织化学染色法(Labelled Streptavidin Biotin Method，LSAB法)检测4组视网膜的谷氨酸转运体(Glutamate/aspartate Transporter，GLAST)表达水平；应用免疫组织化学染色法(LSAB法)检测视网膜上谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)的表达水平情况。结果：对照组、模型组、治疗组的大鼠视网膜GFAP阳性表达IOD值显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组、对照组的大鼠视网膜神经胶质原纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidprotein，GFAP)阳性表达IOD值显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组的大鼠视网膜GFAP阳性表达IOD值显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组、模型组、治疗组的大鼠视网膜GS阳性表达IOD值显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组、对照组的大鼠视网膜GS阳性表达IOD值显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组的大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)阳性表达IOD值显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：芪参益气滴丸可促进视网膜GS和GLAST的表达，降低谷氨酸的高浓度兴奋性毒性功能，保护视网膜神经细胞。

糖尿病；谷氨酸；芪参益气滴丸；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸转运体

引发视网膜神经细胞严重受损的主要原因之一为谷氨酸的高浓度兴奋性毒性。大量研究表明，糖尿病视网膜病变早期可出现谷氨酸循环缓慢，细胞外堆积大量的谷氨酸，浓度上升，导致视网膜神经节细胞凋亡[1-2]。传统糖尿病性视网膜病变的主要研究重点为视网膜毛细血管微循环障碍，且设定为血管病变导致视觉的缺失及视网膜神经细胞的变性[3-4]；糖尿病患者发生眼底可见的微血管变化之前即发生视神经胶质细胞的存活力及细胞功能变化、视网膜神经纤维功能的降低；近年来研究发现，糖尿病视网膜病变除微血管受损外，糖尿病视网膜病变是一种慢性神经阻滞细胞的退行性病变，包括谷氨酰胺代谢病变、激活小胶质细胞、大胶质细胞反应性增生、神经细胞凋亡加速，视网膜血管病变的主要原因可能为神经胶质及神经元的变化[5-6]；血管内皮细胞、神经胶质细胞、神经元细胞是形成糖尿病视网膜病变的重要因素，神经胶质细胞、神经元细胞的功能变化、结构可改变血管的通透性，视网膜血管通透性变化导致谷氨酸由血液进入视网膜实质，引发视网膜神经退行性改变[7-8]；同时与缺乏神经营养因子密切相关，Müller细胞因是神经元与血-视网膜屏障的桥梁，其功能及结构具有独特性，在导致视网膜血管病变的同时，可引发神经元功能障碍[9-10]。视网膜内的重要神经胶质细胞为Müller细胞，细胞突起由内界膜向外界膜伸展，内核层为细胞体，细胞突起可贯穿全层视网膜，将全部视网膜神经元突起及胞体均包绕及接触[11-12]；与视网膜神经元的功能及结构密切相关；糖尿病状态下Müller细胞的改变为表达GFAP水平升高，GFAP为胶质纤维酸性蛋白，是特征性神经胶质细胞标记，最早在大脑星形胶质细胞中的中间丝结构蛋白中发现，其表达水平升高是视网膜神经元受损的间接性指标[13-14]；糖尿病视网膜可表现为胶质反应性活跃性增生，糖尿病视网膜进展的病理性改变为视网膜组织内胶质细胞反应性增生，视网膜中表达GFAP水平显著升高[15]。活血益气类药物可营养周围神经、中枢神经因子功能，可促进变性受损的神经细胞修复功能，增强胶质细胞的代偿功能，对视网膜神经组织细胞具有保护神经功能，促使神经细胞突起生长功能。探析活血益气法对糖尿病视网膜病变大鼠的谷氨酰胺合成酶及谷氨酸转运体的表达水平的影响具有重要的临床价值，故本文建立糖尿病视网膜病变大鼠模型，检测糖尿病视网膜病变大鼠的视神经胶质细胞的谷氨酰胺合成酶、谷氨酸转运体的表达水平，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物维通利华实验动物研究所提供的六周龄SD大鼠SPF级80只，体重180～220 g。

1.2实验药物与试剂芪参益气滴丸(天津天士力制药集团股份有限公司生产，国药准字Z20030139)，羟苯磺酸钙胶囊(商品名：多贝斯，西安利君制药有限责任公司生产，国药准字H20000713)；Dako公司提供的LSAB通用试剂盒，Sigma公司生产的DAB显色剂，Roche公司提供的细胞凋亡检测盒，Sigma公司提供的STZ。

1.3实验仪器Kodak公司提供的Image Plus Pro 6.0图像分析系统；SAKURA CRM-440型病理切片机，SAKURA PS-53型展片器，日本SAKURA Tissue-Tek TECTM5 SM C1-042-SO型组织包埋机，日本OLYMPUS BH-2型显微照相系统，日本日立H-600型电子显微镜，日本OLypus BH-2型光学显微镜，日本OLypus BX-51型数码相机装置，HANNA Instrumrnts-PH-200型酸度计，Mettler Toledo-AB54型精密电子天平，Roche GLUCOTREND型快速血糖仪。

1.4实验方法1)六周龄SPF级SD大鼠80只，体重180～220 g，均为雄性，饲养室相对湿度55%～70%，室温22～25 ℃；实验期间大鼠可自由饮水及进食，适应性饲养7d后，随机分为正常组(例数=10)、实验组(例数=70)，进行STZ一次性腹腔注射，对胰岛β细胞进行选择性破坏，诱发实验性糖尿病；临时将pH 4.4、0.1 mmol/L无菌柠檬酸钠缓冲液配制为1%的STZ溶液，根据大鼠体重，进行1%STZ一次性左下腹腔注射，65 mg/kg，正常组注射体积相同的0.9%氯化钠注射液，建立模型前大鼠12 h禁食，72 h后尾静脉取血，予以快速血糖仪检测血糖；血糖超过16.7 mmol/L者则为糖尿病大鼠模型；随机分为对照组(多贝斯对照组)(20只)、治疗组(芪参益气滴丸组)(30只)、糖尿病模型组(模型组)(20只)、正常组(例数=10)；成功建立大鼠模型后第二天对照组及治疗组给药，灌胃给药1次/d，剂量均为0.5 g/kg，应用蒸馏水配制羟苯磺酸钙胶囊、芪参益气滴丸，配制药物溶液为100 mg/mL，1次/周，于4 ℃冰箱内置存；正常组大鼠予以1 mL 0.9%氯化钠溶液灌胃；实验周期为10个月，期间予以大鼠血糖和体重定期检测；视网膜切片制备：结束试验后将大鼠处死，由颈动脉处放血，将眼球摘除，24 h内在4 ℃下应用4%多聚甲醛固定，顺角膜边缘将眼球壁剪开，将玻璃体、晶体、角膜除去，剩下的眼杯置入固定液内再次48 g固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，二甲苯透明，SAKURA CRM-440型病理切片机连续切片，3 μm切片厚度；进行标记链霉亲合素-生物素过氧化物酶法(LSAB)进行GS、GLAST免疫组织化学染色：1)石蜡切片脱蜡，梯度乙醇水化；2)5 min流水漂洗，5 min磷酸盐缓冲液，洗涤两次；3)15 min3%双氧水氧化，将内源性过氧化物酶消除，5 min流水漂洗，5 min PBS洗涤两次；4)室温下10%正常牛血清(BSA)滴加，20 min湿盒孵育；5)在不同的切片内滴加一抗：兔抗人GS多抗1:50和兔抗人GLAST多抗1:1800,24 h室温下孵育湿盒，5 minPBS洗涤三次；6)LSAB二抗滴加，90 min室温下湿盒孵育，5 minPBS洗涤三次；7)LSAB三抗滴加，90 min室温下湿盒孵育，5 minPBS洗涤三次；8)0.5 min-1 min部分切片苏木素复染，未复染部分3 min流水冲洗，进行图像分析；梯度乙醇脱水，风干，二甲苯透明，树脂中性封片；在光学显微镜下监测所得切片，予以Image Plus Pro6.0图像分析系统定量分析未复染切片，每只大鼠取切片两张，200倍下随机选择视野10处，计算阳性表达积分密度值(IOD)，IOD=平均光密度×面积。见图1～图8。

2　结果

2.14组视网膜表达GLAST表达IOD值情况对照组、模型组、治疗组的大鼠视网膜GFAP阳性表达IOD值显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组、对照组的大鼠视网膜GFAP阳性表达IOD值显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组的大鼠视网膜GFAP阳性表达IOD值显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1　GLAST在正常组视网膜的表达，LSAB法×400，苏木素复染。　　图2　GLAST在模型组视网膜的表达，LSAB法×400，苏木素复染。

图3　GLAST在治疗组视网膜的表达，LSAB法×400，苏木素复染。　图4　GLAST在对照组视网膜的表达，LSAB法×400，苏木素复染。

图5　GS在正常组大鼠视网膜的表达，LSAB法×400，未复染。　　图6　GS在模型组大鼠视网膜的表达，LSAB法×400，未复染。

图7　GS在治疗组大鼠视网膜的表达，LSAB法×400，未复染。　　图8　GS在对照组大鼠视网膜的表达，LSAB法×400，未复染。

2.24组视网膜表达GS表达IOD值变化情况对照组、模型组、治疗组的大鼠视网膜GS阳性表达IOD值显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组、对照组的大鼠视网膜GS阳性表达IOD值显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组的大鼠视网膜GS阳性表达IOD值显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1　4组视网膜表达GLAST阳性表达IOD值情况

注：t/P1为模型组与正常组比较，P<0.05；t/P2为治疗组与正常组比较，P<0.05；t/P3为对照组与正常组比较，P<0.05；t/P4为治疗组与模型组比较，P<0.05；t/P5为治疗组与对照组比较，P<0.05；t/P6为对照组与模型组比较，P<0.05。

表2　4组视网膜表达GS表达IOD值变化情况

注：t/P1为模型组与正常组比较，P<0.05；t/P2为治疗组与正常组比较，P<0.05；t/P3为对照组与正常组比较，P<0.05；t/P4为治疗组与模型组比较，P<0.05；t/P5为治疗组与对照组比较，P<0.05；t/P6为对照组与模型组比较，P<0.05。

3　讨论

本研究探析糖尿病大鼠予以芪参益气滴丸对大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶及谷氨酸转运体的表达影响，研究结果与马栋等[16]的研究结果大体一致，谷氨酸为视网膜的最重要的兴奋性神经递质，神经节细胞、双极细胞、光感受器的递质均为谷氨酸，谷氨酸的浓度不同，其传递的信号也具有一定的差异，而谷氨酸高浓度具有兴奋性毒性，谷氨酸的清除降低或生成增加是导致神经细胞凋亡的主要病理机制，视网膜中的双极细胞及神经节细胞中谷氨酸的唯一源头为Müller细胞，同时可清除视网膜内外过量的谷氨酸，其细胞内的谷氨酰胺合成酶及包膜的谷氨酸转运体是谷氨酸降解、转运的重要过程[17]；谷氨酰胺合成酶只在Müller细胞内存在，Müller细胞对RGCs避免谷氨酸度毒性侵害的作用与GLAST的数量及功能密切相关；在谷氨酰胺合成酶的作用下，谷氨酸可转化为谷氨酸胺，由Müller细胞向细胞外释放，同时神经细胞摄取Gln；传统医学认为，糖尿病属于“消渴”范畴，素体燥热偏盛，阴津亏损，伤阴耗气，引发阴阳两虚、气阴两虚，瘀阻络脉，血行不畅；燥热阴虚、气弱脾虚，阴损及阳，目失所养是糖尿病视网膜病变的基础病机；糖尿病视网膜病变的进展病机为气弱脾虚，因虚致瘀，闭塞目窍，其证候特征为虚实夹杂，本虚标实；糖尿病视网膜病变的增殖前期及单纯期均为气阴两虚证，增殖期为血瘀气滞、阴阳两虚；对糖尿病进行活血益气疗法可防止病变向阴阳两虚状态转变；芪参益气滴丸有降香、三七、丹参、黄芪组成，方中降香辛散气香，行滞温通；三七和丹参可通络祛瘀活血，同为臣药；黄芪为君药，可补气，祛瘀不伤正，气旺则血行，促进津液运行；现代药理研究表明，黄芪的主要有效成分为微量元素、氨基酸、黄酮、皂苷、多糖；其中黄芪多糖可提高机体的缺氧耐受能力，通过抗氧化功能，促使抗氧化酶的GSH-Px、SOD的活性增强，促使细胞膜稳定，促使凋亡抑制基因bcl-2的表达水平提高，p53促凋亡基因的表达下降，降低损伤神经细胞，延缓神经细胞凋亡进程；可促进受损后恢复神经功能，对神经胶质细胞急性脑缺血期的过量表达水平进行抑制；丹参酮及丹参素可缓解微循环障碍，全血粘度下降，对血小板集聚功能进行抑制；避免脂质的过氧化，阻断生成羟自由基。综上所述，芪参益气滴丸可促进视网膜GS和GLAST的表达，降低谷氨酸的高浓度兴奋性毒性功能，保护视网膜神经细胞。

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(2015-12-02收稿责任编辑：张文婷)

Effect of Qishen Yiqi Dripping Pills on the Expression of Glutamate Transporter and Glutamine Synthetase in Diabetic Rats

Luo Gang,Cai Liying

(Huangshi Central Hospital,Hubei Institute of Science and Technology,Hubei 435000,China)

Objective:To investigate the effect of Shenqi Yiqi dripping pills on the expression of glutamine synthetase and glutamate transporters in the retina of diabetic rats.Methods:SD male rats 80,weight 180～220 g were randomly divided into experimental group (n=70) and normal group (n=10).The rats were modeled by STZ injection to induce experimental diabetes.The 1% STZ sterile solution was prepared by sodium citrate buffer PH4.4,0.1 mmol/L,and it was given according to the body weight of rats (65 mg/kg) through left lower abdominal cavity.Common saline were injected of the same volume on the normal group,and blood glucose level was examined by fast blood glucose meter examination after 72 h; mice whose blood glucose level over 16.7 mmol/L were categorized as the model diabetes group,and were randomly divided into the control group (calciumdobesilate control group) (n=20),treatment group (Qishen Yiqi group) (n=30),and diabetic model group (model group) (20 rats).RT-PCR method was used to detect the expression level of mRNA GFAP in four groups of rats.The expression level of glutamate transporter (GLAST) was detected by immunohistochemical staining (LSAB method) and the expression level of glutamine synthetase (GS) was detected by LSAB in four groups.Results:The positive expression of GFAP (Glial fibrillary acid protein) IOD value of the control group,model group,and treatment group were higher than the normal group with statistical difference (P<0.05).The GFAP IOD value in the treatment group and control group were higher than that of the model group (P<0.05).The GFPA IOD value in the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05).The positive expression of GS (Glutamine synthetase) IOD value of the control group,model group,and treatment group were higher than the normal group with statistical difference (P<0.05).The GS IOD value in the treatment group and control group were higher than that of the model group (P<0.05).The GS value in the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05).Conclusion:The expression of and GS and GLAST can be promoted by Qishen Yiqi dripping pills,which can low the toxin of high concentration of glutamate,and thus protecting retinal nerve cells.

Diabetes mellitus; Glutamic acid; Qishen Yiqi dripping pill; Glutamine synthetase; Glutamate transporter

湖北省黄石市医药卫生科研项目(编号：2010-04)

罗钢(1975.09—)，男，嘉鱼人，硕士研究生，湖北省黄石市中心医院主治医师，研究方向：眼科视神经损伤修复、青光眼、眼外伤、白内障等，E-mail：178536802@qq.com

蔡丽英(1977.12—)，女，汉族，大学本科，黄石市中心医院眼科，研究方向：眼底病、角膜病眼底病、青光眼白内障，E-mail：3326884804@qq.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.054