基于LC-MS的小儿哮喘发作期痰热阻肺与非痰热阻肺证代谢标记物研究

陶嘉磊　汪受传　田　曼　梁　慧　戴启刚

(1 江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，南京，210023； 2 南京医科大学附属南京市儿童医院呼吸科，南京，210008)



基于LC-MS的小儿哮喘发作期痰热阻肺与非痰热阻肺证代谢标记物研究

陶嘉磊1汪受传1田曼2梁慧2戴启刚1

(1 江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，南京，210023； 2 南京医科大学附属南京市儿童医院呼吸科，南京，210008)

目的：分析小儿支气管哮喘发作期痰热阻肺证与非痰热阻肺证尿液代谢谱，探索中医不同证候生物学标记物差异。方法：收集24例痰热阻肺证、20例非痰热阻肺证患儿尿液进行液相色谱-质谱检测，运用XCMS Online和MetaboAnalyst分析平台确定差异性代谢物及代谢通路。结果：痰热阻肺证与非痰热阻肺证间能够良好区分，一系列有机酸、氨基酸、脂、酮类等差异性代谢物及代谢通路被确定。与痰热阻肺证相比，非痰热阻肺证组患儿尿中蛋氨酸、琥珀酸、赖氨酸、肌酸、犬尿氨酸、环腺苷酸等多种有机酸、氨基酸，以及多种脂类、酮类化合物含量升高，仅有羟基吲哚乙醛含量降低，主要涉及生物素代谢、色氨酸代谢等5条代谢通路异常。结论：小儿支气管哮喘不同证型间存在代谢标记物与代谢通路基础，可能是中医不同证候区别的本质。

代谢组学；小儿支气管哮喘；痰热阻肺证；中医证候学；液相色谱-质谱联用

支气管哮喘以反复发作性痰鸣喘息、胸闷、呼吸困难或咳嗽为主要表现。由于环境污染等因素，我国小儿支气管哮喘发病呈逐年上升趋势，2010年，14岁以下儿童的患病率较10年前上升32.70%[1]，造成了巨大的家庭和社会负担。中医药防治小儿哮喘历史悠久，疗效明显，有着完善的理法方药体系。目前临床辨证多以南京中医药大学汪受传教授主编的《全国中医药行业高等教育“十二五”规划教材·中医儿科学》为蓝本将小儿哮喘分为发作期、迁延期与缓解期三期，2012年由中华中医药学会制定的《中医儿科常见病诊疗指南》将小儿哮喘发作期分为风寒束肺证、痰热阻肺证、外寒内热证、肺实肾虚证[2]。在实际临床工作中，哮喘证型的辨别多依据医师的个人经验，尚缺乏明确统一的客观化、量化指标，这是制约中医药防治哮喘，走向世界的重要因素。

自系统生物学兴起以来，以整体为核心的组学研究逐渐成为国内外研究的热点，其整体性、动态性、时相性等特点与中医“整体观念、辨证论治”的思维方式相吻合，为解决中医药建立属于自己的标准化体系问题提供了契机[3]。证的物质基础应是一组相关的物质，这些特殊物质群的高低决定着证的发生发展，是证动态变化产生的内在原因。基于代谢产物研究的代谢组学技术正是检测这一组物质群高低、动态变化的优良方法。近年来，国内外众多学者应用各种代谢组学研究技术，在中医证候客观化研究方面进行了有益的探索。早在2005年，Chen MJ等[4]就利用GC/MS技术研究氢化可的松导致肾阳虚模型动物的代谢情况，发现肾阳虚模型组的代谢网络明显偏离正常组，而用温阳中药肉苁蓉干预后，模型动物的代谢谱回归至正常范围，呈现网络修复的结果。本课题采用液质联用检测技术，以小儿支气管哮喘为例，探索痰热阻肺证与非痰热阻肺证分型的物质基础，试图揭示基于代谢组学的小儿哮喘不同中医证候实质。

1　资料与方法

1.1诊断标准西医诊断标准参照2014年全球哮喘防治创议(GINA)方案儿童哮喘内容[5]、中华医学会儿科学分会呼吸学组2008年修订的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[6]。中医诊断标准参照《中医儿科常见病诊疗指南》[2](2012)发作期痰热阻肺证：主症，气喘、声高息涌、喉间哮鸣、咳嗽痰壅、胸闷。兼症，痰黏、色黄、难咯、鼻塞、流涕黄稠、身热、面红唇干、夜卧不安、烦躁不宁、口渴、小便黄赤、大便干、咽红。舌脉，舌质红；苔薄黄或黄腻；脉浮数或滑数，指纹紫。具备主症2项、兼症至少5项，并参照舌脉。发作期其他证型归为非痰热阻肺证。

1.2纳入及排除标准纳入标准：符合支气管哮喘发作期诊断标准及中医发作期证候诊断标准的6～11岁患儿。排除标准：合并心脑血管、肝肾及造血系统等其他原发疾病及精神、神经疾病患儿。伴有呼吸道感染的患儿，有其他肺部疾病患儿，取标本前静脉滴注或口服过激素者。

1.3一般资料选取2015年3—8月在南京市儿童医院哮喘专科门诊、江苏省中医院儿科门诊确诊为支气管哮喘发作期，经中医辨证为哮喘痰热阻肺证与非痰热阻肺证6～11岁患儿。中医辨证均由2名主治及以上职称医师判定。共纳入哮喘发作期痰热阻肺证24例、非痰热阻肺证20例，一般情况见表1。组间患儿年龄、性别、身体质量指数、身高、体重、尘螨过敏、患儿哮喘病程、是否吸入类固醇治疗、肺功能、伴有变应性鼻炎、父母患有过敏性疾病方面均无统计学意义(P>0.05)，组间具有可比性。肺功能作为哮喘诊断的重要检查手段，可以进一步了解气道阻塞的程度，本研究所纳入的儿童均处于哮喘发作期，肺功能异常患儿占比84.4%，有80.7%患儿伴有过敏性鼻炎，同时有84.8%患儿对螨虫过敏，与14年GINA方案小儿哮喘内容相符[5]。

表1　哮喘患儿基本情况

1.4研究方法

1.4.1主要仪器与试剂UltiMate 3000 RS液相色谱仪(UPLC)Dionex，America；二维线性离子阱高分辨静电场组合质谱仪(LTQ/Orbitrap XL)：Thermo Fisher，America；Allegra 64R centrifuge型离心机：Beckman Coulter，America。HPLC级甲醇、乙腈(Merck，Germany)；HPLC级甲酸铵、甲酸(ROE，America)；N,N-二甲基-L-苯丙氨酸标准品(sigma-Aldrich，America)。

1.4.2标本收集留取上午8:30—11:00、下午14:30—17:00期间，门诊患儿中段随机尿约10 mL，保存于-80 ℃冰箱内，避免反复冻融。

1.4.3尿液进样前处理取180 μL尿样室温溶解，加入N,N-二甲基-L-苯丙氨酸(160 μg/mL)10 μL作为内标，再加入400 μL甲醇对尿样进行稀释，振荡涡旋10 min，17 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL进样。

1.4.4尿样本液相色谱及质谱条件色谱柱Hypersil GOLD aQ柱(型号：2.1 mm×150 mm，3 μm I.D.)。流动相：A为含0.01%甲酸、5 mM甲酸铵水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0—2 min：95%A，5%B；2—4 min：95%～50%A，5%～50%B；4—15 min：50%～10%A，50%～90%B；15—18 min：10%A，90%B；18—20 min：10%～95%A，90%～5%B；20—25 min：95%A，5%B；流速为0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。质谱离子源类型为ESI，正离子模式检测，喷雾电压4.5kv，扫描范围80～1 000m/z。

1.4.5统计学方法主要通过XCMS Online分析平台一次性完成物质的分析、鉴别，通过MetaboAnalyst平台分析差异性代谢通路，XCMS Online平台数据分析相关参设置为：polarity：positive，retention time format：minutes，Parameter ID：2 JOBID：10976952；Feature detection，method：centWave，ppm：2.5，peakwidth：5～20，mzdiff：0.01，prefilter peaks：3，prefilter intensity：5 000，noise：1 000；Statistics：Unpaired parametric t-test(Welch t-test)，根据P≤0.05和倍数变化≥1.5，比对Metlin、HMDB、MassBank、KEGG等代谢物谱库，自动鉴定差异性内源性代谢物。

2　结果

2.1LC-MS分析结果痰热阻肺证与非痰热阻肺证LC-MS分析总离子流图(TIC)见图1。横轴为保留时间，纵轴为相对峰强度。从图1可看出组间内源性代谢物的差异，非痰热阻肺证大部分代谢物相对含量高于痰热阻肺证组。平台通过计算给出2组共计44个样本的原始总离子流重叠图和校正后叠加图(图2)，从图上可看出2组样本的峰时间和离子形态基一致，系统相对稳定。平台共分析出3062个特征峰，与数据库匹配初筛的可能性代谢物包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸等多种氨基酸；邻氨基苯甲酸、胍基乙酸、氨基丁酸、丁酸、戊酸、酮戊酸、氨基戊酸、肌酸、苯酸、辛酸、尿刊酸、苯丙酮酸、柠檬酸、牛磺酸、棕榈酸、马尿酸、硬脂酸、龙胆酸盐、乙酰乙酸盐、谷氨酸盐、戊酸盐等多种有机酸盐；苯乙醇胺、谷氨酰胺、酪胺、甲基组胺、色胺、甲氧酪胺、苯乙胺等多种胺类化合物；木糖、阿拉伯糖、核酮糖、木酮糖、核糖、脱氧核糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、山梨糖、蔗糖等多种糖类，以及尿素、尿苷、丙三醇、琥珀酸半醛、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、多巴胺、次黄嘌呤、卟胆原、肌醇、肉碱等其他多种小分子代谢物。

2.2代谢轮廓分析平台根据P≤0.05和倍数变化≥1.5，分析处理2组患儿尿3062个特征峰，筛选出1556个差异峰，并自动生成组间的互动云图(图3)。互动云图中每一个圆点经过数据库检索比对后生成，都代表一个差异性物质，其直观的反应了小儿哮喘发作期不同证型之间的差异。如图可见，与痰热阻肺证相比，非痰热阻肺证大部分代谢物相对含量上调，与总离子流色谱叠加图一致。通过有监督PCA得分图以及PCA荷载图(图4)可见，2组样本具有明显的分离趋势，其代谢表型发生了变异，痰热阻肺证与非痰热阻肺证组样本在多维的平面分布图中有良好区分。有监督PCA荷载图中每个点代表一个特征性离子峰，依据其对整体分度贡献的大小从“0”轴依次向两边排列分布，显示了特征离子峰参数对方差贡献率，从图中可见荷载图各点位分离趋势良好。

图1　痰热阻肺证与非痰热阻肺证总离子流色谱图及叠加图

图2　44个样本的原始总离子流重叠图和校正后叠加图

图3　痰热阻肺证与非痰热阻肺证患儿尿液代谢物互动云图

图4　痰热阻肺证与非痰热阻肺证有监督PCA得分图以及PCA荷载图

系统平台通过分析、比对，共确定痰热阻肺证与非痰热阻肺证差异性代谢物共计38个。见表2，与痰热阻肺证组相比，非痰热阻肺证患儿尿中蛋氨酸、琥珀酸、赖氨酸、肌酸、犬尿氨酸、环腺苷酸等多种有机酸、氨基酸，乙酸异丁酯、对羟基氨酯、视黄醇乙酸酯等多种脂类化合物，去氧皮质酮、甲氧基雌酮、孕烯醇酮、雄烯二酮、醛固酮等多种酮类化合物含量升高，仅有羟基吲哚乙醛含量降低。

表2　痰热阻肺证与非痰热阻肺证组38个差异性代谢物

图5　痰热阻肺证与非痰热阻肺证组差异代谢通路分析图

2.3代谢通路分析使用MetaboAnalyst 3.0将筛选的差异性化合物进行代谢通路分析，根据通路影响值>0.1得到痰热阻肺证与非痰热阻肺证组：A生物素代谢，B赖氨酸降解，C甾类激素生物合成，D硫胺素新陈代谢，E色氨酸代谢共5条相关的差异性代谢通路，如图5。

3　讨论

呼吸系统疾病是目前儿科临床上就诊最多最频繁的病种，代谢组学技术在该领域已得到广泛的应用，其研究成果将有助于临床诊断与治疗[7]。如Bos等[8]利用气质联用技术检测呼出气中的化合物群，认为这种非侵入性的检测方法对诊断急性呼吸窘迫综合征显示出良好的准确性，值得临床推广。哮喘是小儿常见病，代谢组学技术已广泛运用于哮喘的研究，Chang C[9]等通过GC-MS联用技术对轻度持续性哮喘患者的血清进行分析，发现轻度持续性哮喘患者血清代谢物能够与正常组很好区分，琥珀酸盐、肌苷、3,4-二羟基苯甲酸、苯基丙氨酸等表达明显增高，提示哮喘患者呈低氧应激状态，并认为这些差异性代谢物可以作为临床哮喘诊断及治疗的重要参考指标。Michael J等[10]通过LC-MS联用技术对20名哮喘患者血样进行分析，认为鞘脂类代谢改变是反映哮喘控制，细胞对沙丁胺醇反应的一个基本特性。

众所周知，辨证论治是中医学的主要特色，整个疾病诊断、处方、用药都是以“证”为核心，它是基础理论和中医临床连接的桥梁。因此，有关证候的研究一直是中医基础研究的一个核心科学问题。一方面，中医辨证论治的理念使得疾病治疗过程中重视个体化、时相化，重视整体，这是中医疗效显著、不良反应少，又富含人文情怀的主要原因；另一方面，由于中医注重整体，重视个体化的辨证论治理念使得中医很难做到标准化，这又严重限制了中医学临床客观化数据资料的积累分析，难以将中医优良的有效方剂进行临床推广和传承，难以被遵循循证医学理念的国际社会认可。这种矛盾的产生并非是中医理论体系的落后，而是目前利用现代科学技术水平仍然无法准确诠释中医证候的内在本质，证候是疾病与人这个生命体“综合作用”反应的结果，包含了疾病与生命体本身两者的属性特征，更具有全面性，是先进的理论体系。现代医学越来越注重中医的这种整体理念，积极推行个体化治疗，以期能够提高疗效，减少不良反应[11]。目前，以组学为主要技术核心的中医证候学研究是中医药标准化，现代化取得突破的关键点之一。

本项研究以患儿门诊随机尿为样本，临床随机样本的收集是基于患儿当前阶段证候判断后即刻进行的，反映的是患儿当前状态，更符合中医证候实时性这个特点。研究结果显示，非痰热阻肺证患儿尿中的多种有机酸、氨基酸，多种脂类化合物，多种酮类，以及维生素H、维生素B1等生物素含量升高，仅羟基吲哚乙醛含量降低；生物素代谢，赖氨酸降解，甾类激素生物合成，硫胺素新陈代谢，色氨酸代谢，5条异常代谢通路构成了有别于痰热阻肺证特征性的代谢群。因此，支气管哮喘发作期不同证型间存在特征性代谢标记物与代谢通路基础。需要说明的是，中医临床证候学研究实施有一定的难度，其受药物干预、临床证候复杂等多种因素干扰；此外，虽然中医辨证有诊断标准，但医者临诊判断证候类型时不可避免的带有个人主观性，如何突破这一瓶颈，仍是一个需要解决的问题，主观的证候判断通过组学技术的反复验证或许是一条有效的解决途径。

[1]沙莉，邵明军，刘传合,等.2010年与2000年中国城市儿童支气管哮喘患病率比较[J].中华结核和呼吸杂志，2015,38(9):664-668.

[2]中华中医药学会.中医儿科常见病诊疗指南[S].北京：中国中医药出版社，2012：22-23.

[3]陶嘉磊，张宗明，汪受传.从辩证的视角看中医科学性问题争论[J].医学与哲学，2015，36(15):85-87.

[4]Chen M，Zhao L W.Metabonomic Study on the Biochemical Profiles of A Hydrocortisone-Induced Animal Model[J].J Proteome Res，2005，4(6):2391-2396.

[5]Global Initiative for Asthma.Global strategy for asthma management and prevention[EB/OL].Revised，2014.(Assessed May 2014，at www.ginasthma.org.).

[6]中华医学会儿科学分会呼吸学组，《中华儿科杂志》编辑委员会.儿童支气管哮喘诊断与防治指南[J].中华儿科杂志，2008，46(10):745-753.

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(2016-09-09收稿责任编辑：洪志强)

Biomarkers Research on Different Syndromes of Children with Exacerbated Asthma:A LC-MS-based Metabolomics Analysis

Tao Jialei1，Wang Shouchuan1，Tian Man2，Liang Hui2，Dai Qigang1

(1 Jiangsu Key Laboratory of Pediatric Respiratory Disease，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2RespiratoryDepartmentofNanjingChildren′sHospitalaffilliatedtoNanjingMedicalUniversity，Nanjing210008,China)

Objective:By analyzing urinary metabolic profiles of heat-phlegm obstructing lung syndrome and non-heat-phlegm obstructing lung syndrome in children with exacerbated asthma to explore potential metabolic biomarkers between different syndromes.Methods:Twenty-four sick children with Heat-phlegm obstructing lung syndrome and twenty sick children with non-heat-phlegm obstructing lung syndrome were enrolled.Urine samples were collected，and urine metabolites profiles were analyzed by LC-MS coupled with a suite of statistical analyses.Results:Clear separations between heat-phlegm obstructing lung syndrome and non-heat-phlegm obstructing lung syndrome existed.Differential metabolites and several metabolic pathways related organic acids，amino acids，fat，ketone compound were identified.Compared with heat-phlegm obstructing lung syndrome group，the levels of organic acids，amino acids，fat，ketone compound were upregulated，such as methionine，succinic acid，lysine，creatine，kynurenine，and cyclic AMP，and only hydroxy indole acetaldehyde were down in urine with non-heat-phlegm obstructing lung syndrome.Furthermore，five abnormal metabolic pathways，such as biotin metabolism，tryptophan metabolism were identified.Conclusion:The basis of metabolic biomarkers and pathways in children with bronchial asthma exists in different syndrome types，which may be the essence of different TCM syndromes.

Metabolomics； Children with bronchial asthma； Heat-phlegm obstructing lung syndrome；Syndrome of Traditional Chinese Medicine； Liquid chromatography-mass spectrometry

江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室开放课题(编号：JKLPRD201401)

戴启刚(1977.07—)，南京中医药大学副教授，研究方向：小儿肺脾系疾病，E-mail：Qgdai2006@163.com

R241.6

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.007