紫草素下调Runx2转录活性对乳腺癌细胞体外运动能力的影响

王　芳　吕　红　贾娟娣　韩　伟　付剑江.解放军总医院肾脏科，北京0085；.江西中医药大学网络与教育技术中心，江西南昌0004；.江西中医药大学药学院，江西南昌0004

紫草素下调Runx2转录活性对乳腺癌细胞体外运动能力的影响

王芳1吕红2贾娟娣2韩伟2付剑江3
1.解放军总医院肾脏科，北京100853；2.江西中医药大学网络与教育技术中心，江西南昌330004；3.江西中医药大学药学院，江西南昌330004

目的探讨紫草素（SKN）对乳腺癌细胞体外运动能力的影响。方法利用OrisTM细胞迁移试剂盒和重组基底膜侵袭实验检测SKN对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞体外迁移能力和侵袭能力的影响。采用明胶酶谱法观察SKN对MDA-MB-231细胞分泌基质金属蛋白酶（MMPs）的影响。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）和Western blot实验检测SKN对MDA-MB-231细胞内Runx2转录活性及表达的影响。结果给药后，20μmol/L SKN可显著抑制表皮生长因子诱导的细胞迁移作用；重组基底膜侵袭实验中，SKN 10μmol/L和20μmol/L剂量组的侵袭细胞数分别为（514.3±76.8）、（426.3±87.0）个，与空白组［（738.5±126.1）个］比较差异有统计学意义（P＜0.05）；明胶酶谱实验显示，SKN可下调基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的活性；进一步Western blot实验结果表明，MDA-MB-231细胞的MMP-9表达也显著降低（P＜0.01）。Ch IP实验结果显示，SKN可明显下调Runx2与MMP-9基因启动子区内特定序列的结合能力，而Western blot结果发现，SKN可显著抑制磷酸化Runx2的表达（P＜0.01）。结论SKN对MDA-MB-231细胞体外运动功能具有显著抑制作用，这种作用与其抑制Runx2活化、下调Runx2转录活性、抑制MMP-9表达有关。

紫草素；体外运动能力；基质金属蛋白酶-9；Runx2；乳腺癌

紫草为紫草科植物紫草（Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.）、新疆紫草［Arnebia euchroma（Royle）Johnst］、内蒙紫草（Arebia guttata Bunge）的干燥根的统称，具有凉血活血、消炎止痛、解毒透疹等功效，主治血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等［1］。研究表明，紫草的活性成分主要是以紫草素及其衍生物为代表的萘醌类色素，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗艾滋病毒、抗生育、解热、止血、降血糖等广泛的药理作用［1-3］。本文对紫草的主要活性成分之一——紫草素的体外抗乳腺癌转移活性及其机制进行初步探索。

1　材料与方法

1.1实验用药

紫草素（shikonin，SKN）购自Sigma-Aldrich公司（货号S7576，批号120117），BB-94购自Santa Cruz生物技术公司（SantaCruzBiotechnology Inc.，Santa Cruz，CA；货号：SC-203833；批号：1309287），本研究中作为阳性对照药。

1.2细胞株及细胞培养

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库。MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养，置于37℃5%CO2的培养箱内，3～4 d传代1次。

1.3试剂

Matrigel（BDbioscience，#354234）；Fibronectin（FN，Sigma-Aldrich，#F1141）；QIAshredder（Qiagen，#79656）；RNeasy ProtectMini试剂盒（Qiagen，#74124）；OneStep RT-PCR试剂盒（Qiagen，#210210）；Multiplex PCR试剂盒（Qiagen，#206143）；ORIS cell migration assay试剂盒（Platypus Technologies，#CMA1.101）；TransAMTM AML-3/Runx2试剂盒（Activemotif，#44496）；Agarose ChIP试剂盒（Thermo Fisher Scientific，#RA232201）；Phusion®High-Fidelity PCR试剂盒；总蛋白抽提试剂盒（碧云天，#P0027）；抗p-Runx2多克隆抗体（Abgent，#AP3559a）；抗MMP-9单克隆抗体（Santa Cruz，#SC-6840）；抗β-Actin单克隆抗体（Santa Cruz，#SC-130301）。

1.4仪器

AP48 chamber（美国Neuro probe公司）；Mastercycler gradient PCR仪（德国Eppendorf公司）；EC3凝胶成像系统（美国UVP公司）；ELx800酶标仪（美国BioTek公司）；BX63正置显微镜（日本Olymbus公司）。

1.5肿瘤细胞体外迁移实验

采用OrisTM细胞迁移检测试剂盒（Platypus Technology LLC，Madison，WI）进行。收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，配制成浓度为5×106/mL的细胞悬液。将100μL细胞悬液接种于插入了Stopper的OrisTM细胞培养板。37℃、5%CO2孵育5 h。小心拔出Stopper，并更换含药培养液，每个处理重复3个复孔。上述细胞继续培养48 h。处理结束后，弃去培养液，加入浓度为0.5%结晶紫染色60min，PBS洗涤3遍，光学显微镜下观察并拍照，上述实验均重复3次。

1.6重组基底膜细胞侵袭实验

参照文献［4］的方法，采用AP48 chamber细胞趋化试剂盒进行。取孔径为8.0μm的PVPF滤膜，在其粗糙面均匀涂抹50μg纤维连接蛋白（fibronectin，FN），室温静置风干。随后在光滑面均匀涂抹0.5mg/mL Matrigel 100μL，室温静置、干燥。按照说明书安装AP48 Chamber：下室加入30μL含0.1%BSA的无血清DMEM培养基；上室加入50μL含有不同药物浓度的细胞悬液，细胞终浓度为2×106/m L，每个处理重复3个复孔。37℃，5%CO2培养14 h。培养结束后，卸下滤膜，甲醇固定10 min，0.5%结晶紫染色60 min，随后用棉签擦掉滤膜上层细胞，光学显微镜下拍照，并计数5个不同视野内的侵袭细胞数，计算平均值，上述实验均重复3次。

1.7明胶酶谱实验

各组细胞经含药无血清培养基培养24 h后，4℃，相对离心力200×g，离心10min，收集细胞培养上清，细胞则计数。配制8%分离胶和5%浓缩胶，分离胶中含0.1%（W/V）明胶。按细胞数折算出相同细胞数所对应的培养上清体积，并按此加样电泳。电泳完毕后，剥离凝胶，以蒸馏水漂洗后，移入100 m L 2.5%TritonX-100溶液中，在摇床上低速摇动30min，洗脱SDS。随后将凝胶移入100 mL明胶酶缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1μmol/L ZnCl2），37℃温育16 h。凝胶经蒸馏水漂洗后，以0.1%考马斯亮蓝R-250染色4 h。蒸馏水漂洗后，在脱色液（冰醋酸∶甲醇∶水=10∶45∶45）中脱色至对照组出现明显、清晰的负染条带。凝胶在EC3凝胶成像系统中扫描照相。

1.8Ch IP实验

采用Thermo Fisher Scientific的Agarose ChIP试剂盒进行。在经不同浓度SKN处理的细胞中加入终浓度1%的甲醛，孵育10min。随后加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解细胞，并加入微球菌核酸酶孵育5 min。随后加入抗Runx2抗体（终浓度1∶50）沉淀蛋白质-DNA复合物，并以抗兔IgG和抗RNA聚合酶Ⅱ抗体作为阴性对照和阳性对照。回收、纯化DNA。随后采用Phusion®High-Fidelity PCR试剂盒扩增纯化后的DNA，目的片段为MMP-9（GeneBank号：NM_004994）启动子区内的Runx2结合区域（-1133 bp：ACTCCAG）。上游引物和下游引物分别为：5＇-TGG AGC AGG GCT GGA GA-3＇和5＇-CCT GCC AAA AGA CCA TGA TTC T-3＇。扩增条件为：95°C 15min后进入30个循环的扩增：95℃15 s，56℃30 s，72℃30 s。循环结束后，RCP产物置于72℃10 min。实验中，采用未经共沉淀处理的DNA作为input对照，其余处理与共沉淀组相同。

1.9蛋白提取和W estern blot检测蛋白表达

收集各处理组细胞，采用总蛋白提取试剂盒（碧云天，P0027）提取总蛋白，并测定含量。取等量蛋白在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳结束后，转膜、封闭，加入一抗（1∶500）4℃孵育过夜，TTBS洗膜，将二抗按1∶1000稀释后与硝酸纤维素膜室温孵育1 h。经过2次洗涤后，加入显色剂显色、拍照。

1.10统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件包进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SKN对MDA-MB-231细胞体外迁移能力的影响极显著差异，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

2.3SKN对MMPs活性的影响

图3所示为SKN对MMPs活性的影响。SKN可显著抑制MMP-9对明胶的分解，而对于MMP-2的分解作用则没有明显影响（图3A）。Western blot结果

图2　SKN对MDA-MB-231细胞体外侵袭能力的影响

与空白组比较（图1A），经25 ng/mLEGF孵育24 h后，MDA-MB-231细胞向中央空白区域迁移的细胞数量显著增加（图1B）。而阳性对照药BB-94和SKN均可显著抑制MDA-MB-231细胞的这种迁移能力，并呈现剂量依赖关系（图1C～E）。

图1　SKN对MDA-MB-231细胞体外迁移能力的影响

2.2SKN对MDA-MB-231细胞体外侵袭能力的影响

图2所示为SKN对MDA-MB-231细胞体外侵袭能力的影响。空白组的侵袭细胞数为（738.5±126.1）个，而各SKN剂量组的侵袭细胞数分别为（514.3±76.8）、（426.3±87.0）个，与空白组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），其中20μmol/L剂量组的抑制作用呈现显示，SKN可显著抑制MMP-9的表达（P＜0.01，图3B）。提示SKN可能可以通过抑制MMP-9的表达，从而抑制MDA-MB-231细胞的体外迁移和侵袭。

2.4SKN对MDA-MB-231细胞Runx2活性的影响

Ch IP实验结果显示，SKN可显著抑制Runx2与MMP-9基因启动子区域内的靶序列结合，并呈现剂量依赖性（图4A）。Western blot结果显示，SKN可显著抑制磷酸化Runx2的表达，而对Runx2总蛋白的表达则无显著影响（图4B），提示SKN可能可以通过抑制Runx2的活化，下调其转录调控活性。

图3　SKN对MDA-MB-231细胞MMPs的影响

图4　SKN对MDA-MB-231细胞Runx2活性的影响

3　讨论

紫草为传统中药，其化学成分复杂、药理作用广泛，抗肿瘤作用是其中之一。作为紫草的主要活性成分，SKN及其衍生物具有诱导肿瘤细胞凋亡［5］、激活促细胞分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）［6］、抑制蛋白酪氨酸激酶和DNA拓扑异构酶Ⅰ的活性［6-7］。鉴于紫草良好的临床疗效和广泛的民间使用基础，本文探讨了SKN的体外抗转移作用及其可能的作用机制，为紫草的深度开发和利用提供资料。

本研究发现，SKN可显著抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的体外迁移和侵袭能力。进一步研究发现，SKN可显著抑制乳腺癌细胞MMP-9的表达，从而抑制其活性。另外，SKN还可显著降低磷酸化Runx2的表达，并下调Runx2与MMP-9基因启动子区内特定序列的结合能力。

Runx2又称核心结合因子a1（core-binding factor a1，CBFA1），属于runt结构域基因家族的转录因子，目前已发现该家族包括三个成员，即Runx1、Runx2和Runx3，它们的共同特点是在分子结构中含有一个由128个氨基酸组成的高度保守的DNA结合结构域——runt结构域［8］。在成骨细胞分化和骨形态的形成过程中，Runx2扮演了非常重要的作用［9-11］。近年来，研究显示作为一种DNA结合的转录因子，Runx2通过调控其靶基因的表达，在乳腺癌的转移过程中扮演重要角色，是一个关键性的转移因子，并成为转移性乳腺癌治疗药物设计的潜在靶点［12-13］。在转移能力较强的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，Runx2异常活化，核内的表达及活性明显高于低转移性乳腺癌细胞系MCF-7［13］。研究人员通过点突变方法，破坏Runx2基因形成转录调节复合物的能力，可以使得表达该突变蛋白的MDA-MB-231细胞体外侵袭能力以及体内形成溶骨性骨损伤的特性下降。另外将这种带有突变Runx2基因的细胞接种至免疫缺陷小鼠的胫骨骨髓，结果发现与其亲本细胞比较，其肿瘤大小明显降低，同时骨髓内肿瘤引起的溶骨性疾病完全消失［14］。此外，Chimge等［15］的研究还表明，Runx2也参与了乳腺癌细胞上皮-间质转化的调控。

MMPs是一组结构和功能相关的锌离子依赖蛋白酶。目前已经发现了23种人MMPs，其中17种为可溶性MMPs［16］。这一蛋白酶家族成员通过水解细胞外基质、调节细胞黏附、迁移等方式广泛参与肿瘤细胞的侵袭和转移［16］。研究表明，多种MMPs家族成员均为Runx2的靶点。Jiménez等［17］和Selvamurugan等［18］均证实在MDA-MB-231细胞的MMP-13启动子区内存在2个Runx2结合位点。Pratap等［19-20］的研究则提示MMP-9是Runx2下游的另一个调控靶点。研究人员发现，在Runx2突变的小鼠内，MMP-9的表达几乎完全被抑制；ChIP和EMSA实验显示，在MMP-9基因启动子区内有大量Runx2蛋白募集。进一步的knock-in和knock-out实验也提示了MMP-9的表达可以调控MMP-9基因的表达，从而影响肿瘤细胞的转移特性。

综上所述，本研究结果提示，SKN可显著抑制乳腺癌细胞的体外迁移和侵袭能力，其机制可能与抑制Runx2的活化，进而q降低Runx2的转录活性、抑制MMP-9表达有关。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2015.

［2］黄河，刘宗潮.紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用［J］.肿瘤防治杂志，2005，12（1）：75-78.

［3］黎玉红，周晓荣.新疆紫草的研究进展［J］.新疆中医药，2002，20（4）：75-77.

［4］WangW，Chen B，Zou R，et al.Codonolactone，a sesquiterpene lactone isolated from Chloranthus henryi Hemsl，inhibits breast cancer cell invasion，migration and metastasis by downregulating the transcriptional activity of Runx2［J］. Int JOncol，2014，45（5）：1891-1900.

［5］Gaddipati JP，Mani H，Shefali，et al.Inhibition of growth and regulation of IGFs and VEGF in human prostate cancer cell lines by shikonin analogue 93/637（SA）［J］.Anticancer Res，2000，20（4）：2547-2552.

［6］Singh F，Gao D，Lebwohl MG，et al.Shikonin modulates cell proliferation by inhibiting epidermal growth factor receptor signaling in human epidermoid carcinoma cells［J］. Cancer Lett，2003，200（2）：115-121.

［7］Ahn BZ，Baik KU，Kweon GR，et al.Acylshikonin analogues：synthesis and inhibition of DNA topoisomerase-I［J］.JMed Chem，1995，38（6）：1044-1047.

［8］Lian JB，Stein JL，Stein GS，et al.Runx2/Cbfa1 functions：diverse regulation of gene transcription by chromatin remodeling and co-regulatory protein interactions［J］.Connect Tissue Res，2003，44（S1）：141-148.

［9］Karsenty G.Role of Cbfa1 in osteoblast differentiation and function［J］.Semin Cell Dev Biol，2000，11（5）：343-346.

［10］Komori T.Runx2，amultifunctional transcription factor in skeletal development［J］.JCell Biochem，2002，87（1）：1-8.

［11］Stein GS，Lian JB，van Wijnen AJ，etal.Runx2 control of organization，assembly and activity of the regulatory machinery for skeletal gene expression［J］.Oncogene，2004，23（24）：4315-4329.

［12］Owens TW，Rogers RL，Best SA，et al.Runx2 is a novel regulator ofmammary epithelial cell fate in development and breast cancer［J］.Cancer Res，2014，74（18）：5277-5286.

［13］Shore P.A role for Runx2 in normalmammary gland and breast cancer bonemetastasis［J］.JCell Biochem，2005，96（3）：484-489.

［14］Blyth K，Cameron ER，Neil JC.The RUNX genes：gain or loss of function in cancer［J］.NatRev Cancer，2005，5（5）：376-387.

［15］Chimge NO，Baniwal SK，Little GH，et al.Regulation of breast cancer metastasis by Runx2 and estrogen signaling：the role of SNAI2［J］.Breast Cancer Res，2011，13（6）：R127.

［16］Chambers AF and Matrisian LM.Changing views of the role ofmatrixmetalloproteinases in metastasis［J］.JNatl Cancer Inst，1997，89（17）：1260-1270.

［17］Jiménez MJ，Balbín M，López JM，et al.Collagenase 3 is a target of Cbfa1，a transcription factor of the runt gene family involved in bone formation［J］.Mol Cell Biol，1999，19（6）：4431-4442.

［18］Selvamurugan N，Kwok S，Partridge NC.Smad3 interacts with JunB and Cbfa1/Runx2 for transforming growth factor-beta1-stimulated collagenase-3 expression in human breast cancer cells［J］.JBiolChem，2004，279（26）：27764-27773.

［19］Pratap J，Javed A，Languino LR.The Runx2 osteogenic transcription factor regulates matrix metalloproteinase 9 in bonemetastatic cancercellsand controlscellinvasion［J］. Mol Cell Biol，2005，25（19）：8581-8591.

［20］Pratap J，Imbalzano KM，Underwood JM，et al.Ectopic runx2 expression in mammary epithelial cells disrupts formation of normal acini structure：implications for breast cancer progression［J］.Cancer Res，2009，69（17）：6807-6814.

Influence of shikonin for the motility in vitro of breast cancer cells via down-regulating transcriptional activity of Runx2

WANG Fang1LU Hong2JIA Juandi2HANWei2FU Jianjiang3

1.Department of Nephrology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2.Network and Modern Education Technology Center，JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Jiangxi Province，Nanchang 330004，China；3.School of Pharmacy，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Jiangxi Province，Nanchang 330004，China

Ob jective To investigate the influence of shikonin（SKN）for the motility in vitro of breast cancer cells. M ethods The influence of SKN for themigration and invasion in vitro of MDA-MB-231 cells was detected by OrisTMmigration assay and reconstituted basementmembrane invasion assay.Gelatin zymography was used to observe the effects of SKN on MDA-MB-231 cells in secreting matrix metalloproteinase（MMPs）.Chromatin immunoprecipitation（Ch IP）assay and Western blot test were used to detect the influence of SKN for transcriptional activity and expression of Runx2 in MDA-MB-231 cells.Results After administration，20μmol/L SKN could significantly inhibit the cellmigration induced by epidermal growth factor；in the reconstituted basementmembrane invasion assay，the number of invaded cells of 10，20μmol/L of SKN was（514.3±76.8），（426.3±87.0）respectively，which had statistically significant differences compared with that of blank group（738.5±126.1）（P＜0.05）；Gelatin zymography showed that SKN could down-regulate the activity ofmatrixmetalloproteinase-9（MMP-9）；furtherWestern blot showed that，the expression of MMP-9 was decreased significantly（P＜0.01）.The Ch IP assay showed that SKN could down-regulate the combining capacity of Runx2 with the specific sequences of HTT gene-linked polymorphic region in MMP-9，while the results of Western blot found that SKN could inhibit the expression of phosphorylation Runx2（P＜0.01）.Conclusion SKN has significant inhibitory effect for the motility in vitro of MDA-MB-231 cells，which may be related to inhibiting excitation of Runx2，down-regulating the transcriptional activity of Runx2，inhibiting the expression of MMP-9.

Shikonin；Motility in vitro；Matrix metalloproteinase-9；Runx2；Breast cancer

R737.9

A

1673-7210（2016）06（c）-0004-05

国家自然科学基金资助项目（81160530、81260656、81560639）。

付剑江（1975.9-），博士，副教授，从事中药抗肿瘤药理工作。

（2016-02-26本文编辑：张瑜杰）