数码成像比色法测定牛乳中蛋白质的含量

乐 薇，刘 乐（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 4300 65）

数码成像比色法测定牛乳中蛋白质的含量

乐 薇，刘 乐
（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 4300 65）

考马斯亮蓝可与蛋白质生成蓝色复合物，经数码成像后，显色溶液的灰度差值和蛋白质质量浓度呈正比例，据此建立了数码成像比色法测定牛乳中蛋白质含量的方法，并对成像条件、显色条件、干扰物质进行了探讨。结果显示，用于牛乳中蛋白质含量测定时，该法的相对标准偏差小于2%，回收率在97.5%～102.6%之间，结果与考马斯亮蓝分光光度法一致，但更简便、快速。

数码成像比色法；蛋白质；考马斯亮蓝

蛋白质是生命活动不可缺少的成分，因此在食品、医药、生物学中常需检测蛋白质含量，随着分析手段的提高，蛋白质含量的测定方法也越来越准确、快速和灵敏。目前，蛋白质的测定方法有凯氏定氮法[1]、紫外吸收法[2]、比色法[3-9]、红外法[10-12]、高效液相色谱法[13-15]及毛细管电泳分析法[16]等。其中经典的凯氏定氮法存在耗时较长、试剂消耗量大、对环境有污染等缺点，且无法排除其他含氮化合物影响，而其他几种方法则需要有专门的仪器或特定的试剂等，还很难适应现场快速分析的需要，因而开发灵敏度高、简单、便捷且易推广的检测分析方法具有重要的现实意义。

数码成像比色法是将待测溶液显色后，通过数码成像并转换成灰度格式，通过不同颜色深度的灰度值计算出待测物质的含量。该方法是基于电荷耦合器件记录影像，利用红、绿、蓝三基色原理来表达任何一种颜色。在保持背景颜色基本一致的条件下，体系颜色深浅随样品质量浓度成比例变化的趋势可在同一张数码像片中得到充分体现[17]。目前，数码成像比色法已用于测量水体中的总磷[17]和钒[18]、环境及生物样品中亚硝酸根[19]和氰化物[20]、维生素[21]、空气中氮氧化物的日变化曲线[22]等，但鲜见此法测定蛋白质含量的报道。考虑到蛋白质比色法中的考马斯亮蓝分光光度法快速、干扰因素少[23]，故本实验拟采用考马斯亮蓝与蛋白质显色，并通过数码成像来测定牛乳中蛋白质含量，为蛋白质含量的现场快速测定提出新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

考马斯亮蓝（生化试剂）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）标准品 上海源叶生物科技有限公司；尿素、硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵、甘氨酸、谷氨酸、葡萄糖、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），以上试剂均为分析纯。考马斯亮蓝G-250溶液：称取100 mg考马斯亮蓝溶于50 mL 95%乙醇溶液中，再加入100 mL 85%的磷酸溶液，混匀，定容到1 000 mL。

DSC-N2型数码相机 日本Sony公司；756型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；AUY120型电子天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 数码成像比色法测定蛋白质的含量

在一系列10 mL比色管中各加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的100 μg/mL BSA标准溶液，加水至4.0 mL，再加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，用水稀释至10.0 mL，放置5 min后直接数码成像，用ACDsee将其格式转换为灰度格式后，选择图中颜色均匀部分，利用Scion Image软件读出各溶液的灰度峰值，并以未加BSA溶液的灰度值进行校正，绘制灰度差值-BSA质量浓度的标准曲线。移取一定体积稀释一定倍数的牛乳，按标准曲线的制作步骤，得出灰度差值，进行含量计算。同时将上述各溶液以试剂空白为参比测定595 nm波长处的吸光度A。同法制备质量浓度分别为0、2、4、6、8、10 μg/mL的BSA标准溶液，并进行测定。

1.2.2 共存物质对数码成像比色法的干扰影响实验

在一系列10 mL比色管中加入0.2 mL的100 μg/mL BSA溶液，加水至4 mL，各加入0.1 mL 1×10－2mol/L的待测共存物质溶液（尿素、硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵、甘氨酸、谷氨酸、葡萄糖、SDS），作用10 min后，再加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，用水稀释至10.0 mL，放置5 min后直接数码成像，用ACDsee将其格式转换为灰度格式后，利用Scion Image软件读出各溶液的灰度峰值，并以未加BSA溶液的灰度值进行校正，平行实验3 次，取平均值，与未加共存物质的BSA测定溶液的灰度差值进行比较，计算相对误差。

2 结果与分析

2.1 数码成像条件的选择

2.1.1 玻璃仪器的选择

实验分别用试管与比色管进行，按照1.2.1节中的实验步骤进行实验，所拍摄数码照片如图1所示；将实验所得照片用ACDsee转换成灰度格式并用Scion处理得出灰度曲线（图2）。由图2可知，试管与比色管中显色照片的灰度峰值均能随着BSA质量浓度的增大而增大，为了后续定容操作方便，选择比色管进行后续实验。

图1 试管（a）与比色管（b）中显色照片Fig.1 Color development in the test tube (a) and in the colorimetric tube (b)

图2 试管（a）与比色管（b）下的灰度曲线Fig.2 Gray graphs for the test tube (a) and the colorimetric tube (b)

2.1.2 考察拍摄条件

实验分别以硫酸纸和白纸为衬底拍摄照片，按照1.2.1节操作，结果如图3和图4所示。可知硫酸纸背景下曲线比较光滑，而白纸背景条件下曲线呈锯齿状，不光滑，不利于观察各管溶液的灰度峰值，其原因可能是由于白纸的反光率高，造成了拍摄时的光噪增强，而硫酸纸具有防反光作用，可降低光噪，因此选择硫酸纸为本实验的衬底。

图3 硫酸纸（a）与白纸（b）背景下的显色照片Fig.3 Color development observed using white paper (a) and parchment paper (b) as the background

图4 硫酸纸（a）与白纸（b）背景下的灰度曲线Fig.4 Gray graphs obtained using white paper (a) and parchment paper (b) as the background

在自然光照下，以分别以向光与背光为条件拍摄照片，按照1.2.1节操作，得出显色结果（图5）和灰度曲线（图6）。

图5 向光（a）与背光（b）条件下的显色照片Fig.5 Color development observed when the solutions were toward the light (a) and against the light (b)

图6 向光（a）与背光（b）条件下的灰度曲线Fig.6 Gray graphs obtained when the solutions were toward the light (a) and against the light (b)

在两种实验条件下，所得到的曲线均较为光滑，且BSA各质量浓度条件下的灰度峰值基本一致，故向光与背光拍摄对实验结果影响并不大。但同时也发现BSA质量浓度大于8 μg/mL后，灰度值增大趋势减小，说明在后续标准曲线绘制实验中，需适当减小BSA的质量浓度。

2.2 显色条件的优化

参考考马斯亮蓝分光光度法的显色条件选择范围[24]，实验了不同显色时间及显色剂用量对数码成像比色法测定灰度值的影响。

2.2.1 考马斯亮蓝G-250用量的影响

图7 考马斯亮蓝用量对灰度差值的影响Fig.7 Influence of Coomassie brilliant blue dosage on the grey value

由图7可知，随着考马斯亮蓝用量的增加，灰度差值逐渐增加，当加入的考马斯亮蓝用量为4.0 mL时达到最大，此后再增加考马斯亮蓝的用量，灰度差值趋于稳定，考虑到显色剂的适当过量，故选择考马斯亮蓝的用量为5.0 mL。

图8 显色时间对灰度差值的影响Fig.8 Influence of color development time on the grey value

2.2.2 显色时间的影响

由图8可知，随着显色时间的延长，灰度差值逐渐增大，而BSA显色溶液在5～10 min中的增加趋势较平缓，故选择显色时间为5 min。

2.3 共存物质的影响

表1 共存物质对数码成像比色法的影响Table 1 Effect of coexisting substances on the grey value

采用数码成像比色法，考察了一些常见金属离子和牛乳中的添加剂对2 μg/mL BSA溶液的影响，结果见表1，发现K＋、Na＋、Mg2＋、糖类、氨基酸等，不干扰测定或干扰可以忽略，但表面活性剂会干扰测定，这与分光光度法的结果一致[23]，即不干扰分光光度法测定的物质也不干扰数码成像比色法的测定。

2.4 标准曲线的建立

表2 数码成像比色法和分光光度法的标准曲线方程Table 2 Standard curve equations established by digital imaging colorimetry and spectrophotometry

在上述最优条件下，分别获得数码成像比色法和分光光度法的标准曲线方程，结果见表2，可知蛋白质质量浓度在0～10 μg/mL时，数码成像比色法的相关系数明显低于分光光度法，说明数码成像比色法的线性范围比分光光度法要窄。当蛋白质质量浓度范围缩小为0～5 μg/mL时，数码成像比色法的相关系数与分光光度法相当，但数码成像比色法线性拟合的方程斜率远大于分光光度法，说明数码成像比色法的灵敏度更高。

2.5 样品测定及回收率实验结果

取0.40 mL稀释10 倍的牛乳样品液，按1.2.1节操作，测定牛乳中蛋白质的含量，并对样品溶液进行了平行测定。为验证实验方法的准确性，也进行了加标回收实验，结果见表3和表4。

表3 样品测定的结果Table 3 Analytical results for milk samples using digital imaging colorimetry

表4 数码成像比色法与分光光度法测定结果对比Table 4 Comparison of the results obtained by digital imaging ccoolloorriimmeettrryy aanndd ssppeeccttrroopphhoottoommeettrryy ffoorr tthhee pprrootteeiinn ccoonntteenntt ooff ssppiikkeedd milk samples

由表3和表4可知，数码成像比色法与考马斯亮蓝分光光度法相比较，实验结果比较准确，样品回收率在97.5%～102.6%之间，误差在±3%以内，相同质量浓度的测定结果与考马斯亮蓝分光光度法结果基本一致，因此样品可用数码成像比色法进行测定。

3 结 论

考马斯亮蓝溶液与蛋白质质量浓度作用的数码相片中，溶液的颜色随着蛋白质质量浓度的增加而逐渐加深，不同颜色梯度的灰度差值与蛋白质的质量浓度呈很好的线性关系，表明数码成像比色法能用于蛋白质含量的测定。对比考马斯亮蓝比色法与数码成像比色法，数码成像比色法灵敏度显著提高，且样品和标准系列溶液的测定可在同一张数码照片上进行，整个系统更简单，操作更方便，适合用于现场快速分析，但应注意数码成像比色法的线性范围比分光光度法窄，因此在样品测定中要控制好质量浓度。

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Determination of the Protein Content of Milk by Digital Imaging Colorimetry

YUE Wei, LIU Le
(College of Environmental and Biological Engineering, Wuhan Technology and Business University, Wuhan 430065, China)

The grey value obtained by digital imaging for the blue complex formed from the binding interaction of Coomassie brilliant blue with proteins is positively linearly related to the concentration of proteins. Thus, a method was established for the determination of the protein content of milk by digital imaging colorimetry. The imaging conditions, color development conditions and interfering substances were investigated. The recovery rates for spiked milk samples were between 97.5% and 102.6% with a relative standard deviation (RSD) less than 2%. Consistent results were obtained using digital imaging colorimetry and spectrophotometry, but digital imaging colorimetry was more convenient and faster.

digital imaging colorimetry; protein; Coomassie brilliant blue

10.7506/spkx1002-6630-201604027

TS207.3

A

1002-6630（2016）04-0154-04

乐薇, 刘乐. 数码成像比色法测定牛乳中蛋白质的含量[J]. 食品科学, 2016, 37(4): 154-157. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604027. http://www.spkx.net.cn

YUE Wei, LIU Le. Determination of the protein content of milk by digital imaging colorimetry[J]. Food Science, 2016, 37(4): 154-157. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604027. http://www.spkx.net.cn

2015-03-06

乐薇（1979—），女，副教授，硕士，研究方向为生物分析。E-mail：yuewei11@126.com