深港两地工程土壤真菌多样性分析

龙 海， 章桂明， 汪 莹， 程颖慧， 李芳荣， 王 颖， 高瑞芳， 李一农*

(1.深圳出入境检验检疫局，广东深圳 518001；2.深圳市检验检疫科学研究院，深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东深圳 518045)



深港两地工程土壤真菌多样性分析

龙 海1，2， 章桂明1， 汪 莹1，2， 程颖慧1， 李芳荣1， 王 颖1， 高瑞芳1， 李一农1*

(1.深圳出入境检验检疫局，广东深圳 518001；2.深圳市检验检疫科学研究院，深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东深圳 518045)

[目的]对深圳和香港工程土壤的真菌种类进行检测。[方法]以深圳和香港两地不同深度(0.5、10.0、20.0和30.0 m)的工程土壤为研究对象，结合形态学和ITS序列扩增并测序的方法，分析土壤真菌多样性。[结果]共分离得到934个菌株，分别属于79个属132种。深圳土壤有14个属19种；香港土壤有73个属122种。66个属113种只在香港有分布；7个属10种只在深圳有分布。深港两地均有分布的有7个属9种。[结论]深港两地工程土壤真菌种类有一定差异性；香港工程土壤真菌种类较多，其中还包括多种植物病原真菌，土壤入境前必须进行检疫处理。

工程土壤；真菌多样性；形态学；分子生物学

近年来，随着我国“一带一路”战略的深入推进，与周边国家或地区的跨境工程也正在筹划或开工建设中，一部分工程土壤有可能会进入我国境内。这就会涉及到土壤检疫问题，而我国目前缺乏相应的检疫标准或方法。为了应对可能出现的问题，笔者以深港两地不同深度的工程土壤为研究对象，结合形态学和分子生物学分析土壤真菌的多样性，以期为后续风险分析和土壤检疫处理提供科学依据。

1　材料与方法

1.1供试土样在香港设3个取样点，在深圳设2个取样点，每个取样点分别在0.5、10.0、20.0和30.0 m土层处各取1份样品，每份样品3～5 kg，装入封口袋，置于土壤采集专用保藏箱(4 ℃)，并应尽可能在原有状态下迅速送回实验室，-20 ℃保存。采样地点见表1。

1.2样品制备将现场取回的20个原始样品分别置于灭菌的搪瓷盘中混匀，制成平均样品，棋盘式取5个平行样，每个样品100 g，研磨，用孔径为2 mm的筛网过筛，去除杂质。共有100个试验样品。

1.3分离接种将试验样品每个称取10 g加入盛有100 mL无菌水的500 mL三角瓶中，置于振荡器上振荡20 min，使土壤均匀分散在稀释液中成为土壤悬液。土壤分散后，吸取5 mL土壤悬液到45 mL稀释液中，依次按10倍法稀释到10-3。 取1 mL 悬浮液均匀涂抹在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基平板上，于25 ℃ 培养。

表1　采样地点及其地理坐标

1.4分离纯化及菌株保存培养第2天开始观察并记录菌落数，对长出的菌丝及时纯化到PDA培养基上，观察记录菌落的生长速度、颜色变化、孢子的形成情况等，并拍照和保存菌种。

1.5分子生物学检测

1.5.1病菌的DNA提取。采用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)试剂盒提取真菌菌丝DNA。

1.5.2内转录间隔区(ITS)PCR扩增、测序和分析。应用引物ITS4(5′- TCCTCCGCTTATGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG - 3′)[1]对DNA 进行PCR 扩增。PCR 反应总体积为50.0 μL，反应体系：10×Buffer(含Mg2+)5 μL，2.5 μmol/L dNTP 5.0 μL，10 μmol/L ITS4/ITS5 各1.0 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.3 μL，模板DNA 1.5 μL，加ddH2O至50.0 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min，经35个循环(92 ℃变性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s)，最后72 ℃延伸10 min[1]。取5.0 μL扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit纯化回收试剂盒纯化，方法按照说明书进行。纯化后的PCR产物送至上海基康生物技术有限公司进行测序分析。用BioEdit 7.0[2]对序列进行编辑，在GenBank 数据库 (www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLAST分析。

2　结果与分析

2.1分离纯化对广深港隧道工程5个取样点共20份原始土壤样品进行分离培养，共计934个菌株。各取样点分离纯化的菌株数和鉴定的种属数见表2。由表2可知，取样点A分离得到的菌株数最多，达373个，取样点E分离得到的菌株数最少，仅118个；属数以取样点C最多，达37个，取样点D最少，仅9个；种数以取样点A最多，达55个，取样点D最少，仅12个。对这些菌株全部进行了菌种保存和DNA提取。

表2各取样点土壤中分离出的菌株数和鉴定的种属数

Table 2The number of fungal strains isolated and species/genus identified in the soil of each sampling point

取样点Samplingsites菌株数Thenumberofstrain属数Thenumberofgenus种数ThenumberofspeciesA3733655B1623354C1303749D151912E1181015

2.2真菌多样性由表3可知，深港两地工程土壤中共鉴定出79个属132个种真菌。香港土壤样品中有真菌73个属122种；深圳土壤样品中有真菌14个属19种。其中，66个属113种真菌只存在于香港段土壤样品中；7个属10种真菌只存在于深圳段土壤样品中。深港两地工程土壤样品中都存在的真菌为7个属9种。

表3　深港两地工程土壤中的真菌多样性[3-4]

接下表

3　结论与讨论

(1)该研究结果表明， 深港两地工程土壤中的真菌种类有差异。从各取样点的菌株和属、种数量来看，香港米埔鱼塘A点分离到的菌株数远远多于其他各取样点分离到的菌株数，而其他4个取样点分离到的菌株数量相差不多；对于属和种的数量，香港取样点的数量明显多于深圳取样点，原因有待进一步研究。深港两地土壤样品中的真菌优势种群为青霉菌、镰刀菌和曲霉菌，这些真菌种类繁多，分布广泛，适应性强。香港土壤样品中的特有种类大多是植物病原真菌，需要做进一步的风险分析和致病性研究。

(2) 用分离培养和形态学方法鉴定土壤中的真菌，缺点是周期较长，鉴定结果不准确，分离到的一些菌株鉴定不到种属等。为了弥补形态学方法的不足，笔者利用分子生物学方法对形态学的鉴定结果进行验证，尽量确保鉴定结果的准确性。对于土壤中不可培养的真菌，只能利用分子生物学方法进行检测和鉴定。末端限制性片段长度多态性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP)技术和变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)指纹图谱技术都可用于土壤真菌多样性的分析[5-6]。这2种方法的优点是能够较快和较全面地分析土壤中真菌群落的构成，缺点是难以得到菌株和进行后续研究。采用分离培养方法和分子生物学方法鉴定土壤真菌各有优缺点，可根据不同研究目的进行选择，以期得到较为理想的结果。

[1] WHITE T, BRUN J, LEE S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic[C]//INNIS M A, GLEFAND D H, SNINSKY J J, et al.PCR protocols: Acquire to methods and application.New York:Academia Press,1990:315-322.

[2] HALL T A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignmenteditor and analysis program for windows 95/98/NT[J].Nucleic acids symposium Series, 1999, 41:95-98.[3] 中华人民共和国WTO/TBT-SPS国家通报咨询中心.中国国家有害生物检疫信息平台[DB/OL].www.pestchina.com.

[4] CABI.Crop protection compendium[M].Wallingford,UK:CAB International,2016.

[5] 尹承苗，王功帅，李园园，等.连作苹果园土壤真菌的T-RFLP分析[J].生态学报，2014,34(4)：834-846.

[6] 夏围围，贾仲君.高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价[J].微生物学报，2014,54(12)：1489-1499.

Analysis of Fungal Diversity in Engineering Soils from Shenzhen and Hongkong

LONG Hai1,2,ZHANG Gui-ming1,WANG Ying1, 2,LI Yi-nong1*et al

(1. Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen, Guangdong 518001;2. Shenzhen Key Laboratory of Inspection Research & Development of Alien Pests,Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen, Guangdong 518045)

[Objective] The aim was to detect the fungal diversity in engineering soils from Shenzhen and Hongkong. [Method]The engineering soils of different depths (0.5, 10.0, 20.0 and 30.0 ) in Hongkong and Shenzhen were studied.The fungal diversity in soil was analyzed by the methods of morphological and ITS region amplification and sequencing.[Result]A total of 934 strains were isolated, belonging to 79 genera and 132 species, respectively. There are 14 genera and 19 species in the soil sample of Shenzhen. There are 73 genera and 122 species in that of Hongkong. 66 genera, 113 species are distributed only in Hongkong; 7 genera, 10 species are distributed only in Shenzhen. 7 genera, 9 species are distributed in Shenzhen and Hongong.[Conclusion]The differences of fungal species in engineering soils between Shenzhen and Hongkong are significant.There are many kinds of fungi in the soil of Hongkong project, including many plant pathogenic fungi.Before entering, the soil must be treated with quarantine.

Engineering soils; Fungal diversity; Morphology; Molecular biology

国家质检总局科技计划项目(2015IK266)。

龙海(1979- )，男，安徽蒙城人，高级农艺师，博士，从事进出境植物检疫工作。*通讯作者，研究员，从事植物病理学研究。

2016-07-20

S 154.3

A

0517-6611(2016)27-0097-03