关苍术两性花与雌花花药的解剖学研究

具红光，全雪丽，崔馨月，李美善，朴　锦

( 延边大学 农学院，吉林 延吉 1330021 )



关苍术两性花与雌花花药的解剖学研究

具红光，全雪丽，崔馨月，李美善，朴锦*

( 延边大学 农学院，吉林 延吉 1330021 )

苍术属(AtractylodesDC.)是菊科菜蓟族(Cynareae)刺苞亚族(Carlininae O. Hoffm.)的一个东亚特有属，世界上仅有7 种，其中我国有5 种。该研究以关苍术为材料，采用石蜡切片法比较研究了两性花和雌花的花药及雄配子体发育进程，并进一步探讨了其雌花产生花药退化的时期及原因。结果表明：(1)关苍术小孢子发育与花蕾长度间存在相关性，当花蕾长度在5 mm时进入花粉母细胞时期，花药壁已分化，在7～9 mm时处于四分体时期，大于11 mm时开始进入花粉粒时期。(2)关苍术花药5 个，花粉囊4 个，减数分裂属同时型，四分体以正四面体为主，属3-细胞型，萌发沟3个。(3)关苍术花粉囊壁发育属双子叶型，从外层的表皮、药室内壁，到内层的中层和绒毡层均由一层细胞构成，关苍术绒毡层为腺质绒毡层。(4)关苍术雌花花药退化发生在花药发育早期至四分体时期，表现为花药发育早期畸形、药壁分化异常、小孢子母细胞发育停滞在前期、绒毡层增生4个原因。该研究结果为苍术属植物的系统发育、物种形成和进化提供胚胎学依据。

关苍术, 花药发育, 聚药雄蕊, 退化雄蕊, 雄配子体

苍术属隶属菊科菜蓟族(Cynareae)刺苞亚族(Carlininae O.Hoffm.)，世界上仅有7 种，其中我国有5 种，分别为茅苍术、朝鲜苍术、北苍术、关苍术和鄂西苍术(石涛，1987)。关苍术(Atractylodesjaponica)主要分布在我国东北的吉林省、黑龙江省、辽宁省，是当地特色药食兼用植物(马玲等，2012)。关苍术味辛、苦，性温，归脾、胃、肝经，具有祛风湿、燥湿健胃、明目等功效，能治食欲不振、肢节酸痛、胸痞腹胀、夜盲及湿困脾胃等疾病(南京中医药大学，2006)。2003年，关苍术在抗击非典过程中脱颖而出，因而越来越多的人们关注其药用价值(丁立威，2012；比十，2008)。国内市场上关苍术商品主要来自于野生资源，但近几年主产区东北三省的野生资源急剧减少(王春亮，2004)。因此，迫切需要实现人工栽培和野生抚育，保证其资源的可持续利用。朴锦等(2015)通过对关苍术的调查发现，无论是野生还是人工栽培的关苍术，单果结实率都很低，一般在40%左右；朴锦等(2015)通过关苍术繁育系统的研究发现，关苍术属于专性异花授粉植物，两性花和雌花的比例接近1∶1，从而使大部分雌花由于花粉紧缺而无法完成授粉，是降低结实率的主要原因之一。

目前，有关苍术属植物有效成分、药理作用及栽培方面的研究报道逐渐增加，而对胚胎学及细胞遗传学方面的研究尚见甚少。因此，本研究对关苍术花药及雄配子体发育过程进行系统观察，探讨雌花花药退化的原因及发生时期，为苍术属的系统发育、物种形成和进化提供胚胎学依据。

1　材料与方法

1.1 材料

于2014年7月6-8日，在延边大学中药材种植基地的关苍术种质资源圃，用手术刀片分别切取不同时期的两性花和雌花花蕾。材料按花蕾长度(<4、5～7、7～9、9～11、11～13 mm及大于13 mm)的6个标准来划分。

1.2 方法

将切取的花蕾用FAA固定，取出后用小镊子剥掉外围的总苞片，放入氢氟酸(HF)溶液中浸泡2 d进行预处理(每天更换1次氢氟酸溶液)。常规石蜡切片法制片，用徕卡石蜡切片机(RM 2016)切片，厚度为10 μm，染色用番红-固绿，中性树胶封片，利用光学显微镜(OLYIMPUS)找出各发育时期，同时显微照相。

表 1　关苍术小孢子发育与花蕾长度相关性

图版 Ⅰ　关苍术小孢子发生及雄配子体的形成　 1. 花序发育初期；2. 花粉囊；3. 孢原细胞；4. 造孢细胞；5. 绒毡层；6. 花粉母细胞时期；7-8. 花药壁已分化；9. 第一次核分裂；10-13. 四分体时期；14. 小孢子；15-16. 形成萌发沟(核花粉粒初期)；17. 单核花粉粒；18. 单核靠边期；19. 二核花粉粒；20. 三核花粉粒；“—”为标尺，均为50 μm。Ep. 表皮；En. 药室内壁；ML. 中层；Ta. 绒毡层；Gc. 生殖细胞；VC. 营养细胞；PS. 初生造孢细胞；PP. 初生壁细胞；SS. 次生造孢细胞；Tr. 四分体。Plate Ⅰ　Emergency of microspore and male gametophyte for Atractylodes japonica　 1. Early inflorescence development; 2. Pollen sacs; 3. Archesporial cell; 4. Sporogenous cell; 5. Tapetum; 6. Pollen mother cell stage; 7-8. Anther wall of differentiated; 9. The first mitotic figures; 10-13. Tetrad stage; 14. The microspore; 15-16. Germination ditch(Early nuclear pollen grains); 17. Mononuclear pollen grains; 18. Mononuclear aside period; 19. Two nuclear pollen grains; 20. Three nuclear pollen grains; Bars for 50 μm. Ep. Eplidermis；En. Endothecium；ML. Middlelayer；Ta. Tapetum；Gc. Generative cell；VC. Vegetative cell；PS. Primary sporogenou scell；PP. Primaryparietal cell；SS. Secondary sporogenous cell；Tr. tetrad.

图版 Ⅱ　关苍术退化雄蕊发育过程　a. 畸形花药；b. 花粉囊退化；c. 空花粉囊；d. 畸形排列的花粉囊；e. 绒毡层细胞和小孢子母细胞成团；f. 绒毡层不溶解；g-h. 小孢子相互粘连；i. 绒毡层退化；j. 异常绒毡层；k. 花粉粒时期(绒毡层不溶解)；l. 成熟花粉粒(绒毡层不溶解);“-”为标尺，均为50 μm。Plate Ⅱ　Development process of staminode for Atractylodes japonica　 a. The abnormal anthers；b. Anther degeneration；c. Empty pollen sac；d. Anther deformity ranging；e. Tapetum cells and microspore mother cells group；f. Tapetum dissolved；g-h. Mutual adhesion；i. Tapetum degeneration；j. Abnormality of tapetum；k. Pollen grain stage (Tapetum dissolved)；l. Mature pollen grains (The tapetum dissolved)；Bars are 50 μm.

2　结果与分析

2.1 花蕾长度与小孢子发育相关关系

关苍术小孢子发育与花蕾长度间存在相关关系。当花蕾长度小于4 mm时，处于发芽分化初期和花药壁形成期；花蕾长度在5～7 mm时，进入花粉母细胞时期，花药壁已分化；长度在7～9 mm时处于四分体时期，此时绒毡层细胞已成熟，达到最大；长度在9～11 mm时处于四分体的后期，大部分出现胞质分裂现象，绒毡层开始解体；花蕾长度大于11 mm时开始进入花粉粒时期，形成萌发沟；花蕾长度在13 mm 以上时，花粉粒已成熟(表1)。

2.2 关苍术小孢子各发育阶段细胞学特征

关苍术花分为两性花或雌花，两性花盛开后直接能观察看到淡紫色的聚药雄蕊围绕在花柱周围，其聚药雄蕊是5个花药联合而成，纵切后可看到释放在筒内的成熟花粉粒，散粉之后聚药雄蕊由淡紫色变为枯黄色；雌花盛开后花柱周围无聚药雄蕊，掰开花瓣基部露出5 个分离的箭头状退化雄蕊。

关苍术于5 月末进入生殖生长，花序发育初期(图版Ⅰ：a)，花芽分化整齐。关苍术具有5 个花药，花药横切面呈蝴蝶状，具4 个花粉囊(图版Ⅰ：b)，早先由一群分裂活跃的基本分生组织来构成花药，之后4 个角隅处的表皮下分化出孢原细胞，孢原细胞通过平周分裂形成初生造孢细胞和初生壁细胞(图版Ⅰ：c)，初生造孢细胞再经过有丝分裂形成次生造孢细胞(图版Ⅰ：d)，之后次生造孢细胞逐渐发育成体积大、排列紧密、核大的圆形状小孢子母细胞，(图版Ⅰ：f)；小孢子母细胞经减数分裂的第一次分裂后形成2个子核，但其胞质不发生分裂，因此没有二分体时期(图版Ⅰ:i)，接着进入第二次分裂形成4 个子核(图版Ⅰ:j)，在四个子核之间同时形成细胞壁，成四分体(图版Ⅰ:k)，即胞质分裂属同时型。四分体时期4 个小孢子被包裹在共同的胼胝质中，排列方式多数为正四面体(图版Ⅰ:k)，少有十字型(图版Ⅰ:l)或环型(图版Ⅰ:m)，随后胼胝质壁溶解，4个小孢子被释放出形成游离单核小孢子(图版Ⅰ:n)。

2.3 花药壁的发育

在初生造孢分裂形成小孢子母细胞时，初生周缘细胞也通过分裂、分化而形成花药壁。另外，初生壁细胞通过分裂产生排列成同心圆的细胞层(图版Ⅰ：d)；次生壁外层发育为药室内壁和中层，次生壁内层发育为绒毡层，刚分化的绒毡层紧贴中层细胞(图版Ⅰ：e)，而成熟后的绒毡层逐渐远离中层，紧紧围绕着小孢子母细胞(图版Ⅰ：g)。按照 Davis (1966)的划分标准，关苍术药壁发育属于双子叶型，表皮、药室内壁、中层、绒毡层均为一层(图版Ⅰ：g,h)。表皮细胞呈扁平状，细胞核较大，进行垂周分裂，花药成熟时表皮细胞形态变得不规则(图版Ⅰ：i)。药室内壁紧挨着表皮内侧，细胞核大，发育后期内壁细胞开始径向延长，体积逐渐变大(图版Ⅰ：q)，在单核花粉粒时期出现纤维加厚的现象。中层位于药室内壁的内侧，由一层细胞组成，体积小，一直处于扁平状，孢子形成后中层完全解体(图版Ⅰ：n)。

初期的绒毡层细胞是单核，扁平状和其他花药壁细胞区别不大；随着花药的发育，绒毡层细胞逐渐远离中层细胞，靠近小孢子母细胞，体积变大，细胞质变浓，呈长方形。绒毡层细胞随着减数分裂逐渐变大，到四分体时期达到最大值，这时出现2 核至多核(图版Ⅰ：l, m)；四分体时期结束后绒毡层细胞开始解体，但溶解解体的速度在各花粉囊的表现有差异，有的刚进入四分体就开始溶解(图版Ⅰ：j)，而有些是萌发沟形成为止绒毡层未完全溶解(图版Ⅰ：p)，关苍术绒毡层细胞不发生内壁和径向壁的破坏现象，原生质体保持完好，因此属腺质绒毡层(或分泌型)；当花粉成熟后，绒毡层细胞完全溶解掉(图版Ⅰ：q)，花药壁只剩表皮细胞和药室内壁两层。

2.4 关苍术雄配子体发育

新产生的小孢子，细胞质比较浓、细胞核位于中央。小孢子从四分体释放后从周围吸取绒毡层的分泌物或其降解物，体积增大，柱状结构上沉积孢粉素，形成花粉外壁及三条萌发沟(图版Ⅰ：o，p)，进入单核花粉粒时期(图版Ⅰ：q)；单核花粉粒细胞质明显液泡化，逐渐形成中央大液泡，细胞核被挤向壁一侧，进入单核靠边期(图版Ⅰ：r)；此后，细胞核在近壁处不均等分裂，形成不同形状的两个细胞，圆形状靠近液泡的即为营养细胞，弧形状靠近花粉粒壁的为生殖细胞(图版Ⅰ：s)；生殖细胞渐渐伸长，呈纺锤形，再进行1次有丝分裂，形成两个精细胞，成为3-细胞型花粉粒(图版Ⅰ：t)。

2.5 关苍术雌花退化雄蕊的发育异常的观察

关苍术雌花的雄性不育在形态上表现为花药退化型，花药变形，呈箭头状，发生扭曲或全部干瘪，雌花花药发育的不同阶段观察到多种变异类型(图版Ⅱ)。 雌花大部分花药在发育早期即形成畸形 (图版Ⅱ：a)，有的花药原始体虽然形成蝴蝶状,但其花粉囊全部皱缩退化(图版Ⅱ：b)，或空花粉囊、看不到花粉母细胞(图版Ⅱ：c)，而有的花药原始体直接发育为异常，呈一字排列(图版Ⅱ：d)；少数花粉母细胞可进入减数分裂，但后期表现如下：第一，绒毡层与小孢子混成一团物质(图版Ⅱ：e)；第二，到花药发育后期，绒毡层细胞仍然不发生解体(图版Ⅱ：f)，反而药室内壁和表皮层却消失(图版Ⅱ：h)；第三，四分体时期胼胝质壁较早溶解，使小孢子相互粘连一团，形成不规则形状(图版Ⅱ：g)；第四，花药壁分化时，药室内壁和中层细胞增大，而绒毡层异常分化(图版Ⅱ：i)，绒毡层细胞畸形紧贴中层细胞(图版Ⅱ：j)，绒毡层增厚(图版Ⅱ：k)、徒长，挤压小孢子为不规则状或被挤压混成一团物质(图版Ⅱ：l)。

3　讨论与结论

本研究中，关苍术小孢子发育与花蕾长度间存在相关关系，当花蕾长度在4～5 mm进入花粉母细胞时期，花药壁已分化，在7～9 mm时处于四分体时期，大于11 mm时开始进入花粉粒时期。本研究表明，关苍术的胚胎学特征表现为花药发育过程共经历孢原细胞、造孢细胞、小孢子母细胞、四分体、小孢子、成熟花粉粒等具有双子叶植物花药发育的典型特性。其小孢子母细胞是同时型胞质分裂，无明显的二分体时期，四分体多数为正四面体排列。而菊科植物的成熟花粉粒多数为3-细胞花粉粒，但也存在2-细胞花粉粒，如牛膝菊(胡铁锋，2012)、黄顶菊(郑书馨等，2009)等植物的成熟花粉粒是2-细胞型。通过本研究发现，关苍术的成熟花粉粒属于3-细胞型。

黄衡宇等(2009)、郑书馨等(2009)和马虹等(2000)的研究发现，多数菊科植物的药壁发育都属于双子叶型。但也有例外，如黄花蒿(荆风雪等，2014)药壁发育类型属单子叶型，牛膝菊(胡铁锋，2012)药壁发育类型属简化型。本研究结果发现关苍术药壁发育属于双子叶型，由外到内4层细胞组成，即表皮、药室内壁、中层和绒毡层。Pullaiah(1984) 指出绒毡层类型是菊科具有重要系统学意义的胚胎学性状之一。关苍术的绒毡层类型为腺质绒毡层，无原生质体突出并移动至花药腔的现象，其结果有别于菊科植物普遍的变形绒毡层。因此，可以认为菊科的不同植物药壁发育类型和绒毡层类型间存在着差异。

植物雄性不育系花粉败育的形成时期具有多样性，单子叶植物花粉败育多数在接近双核期或双核期时，双子叶植物花粉败育则多在四分小孢子时期或小孢子早期发育阶段(Laser et al，1972)。目前，有关植物雄性不育的研究比较多，特别是有关不育花粉发育、绒毡层、孢粉素及胼胝质等研究。通过对关苍术雌花花药发育过程的观察，其花药退化原因及时期可归结为以下几点：(1)花药在发育早期即形成畸形，表现为花粉囊皱缩退化或空花粉囊；(2)雌花花药壁的发育异常，表现为药壁细胞排列非常松散、药室内壁和中层细胞增大或绒毡层未能正常分化；(3)花粉囊内的大部分小孢子母细胞发育止步于减数分裂前期，不能进入四分体时期；(4)完成减数分裂形成小孢子或单核花粉粒的少部分花药，因其绒毡层细胞不能及时解体，反而增生、徒长或径向增生充塞花粉囊室，挤压花粉粒而不能形成有功能的花粉粒。

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Anatomical studies of hermaphrodite and female flower anther development ofActractycodesjaponica

JU Hong-Guang，QUAN Xue-Li，CUI Xin-Yue, LI Mei-Shan, PIAO Jin*

( College of Agricultural, Yanbian University, Yanji 133002, Jilin，China )

AtractylodesDC. is a special Carlininae O. Hoffm. of Cynareae in Northeast Asia. Among the only 7 varieties in the world there are 5 in our country. Anther development and the developing process of male gametophyte ofActractycodesjaponicawere studied by paraffin method, and the causes and occurrence period of the female flowers anther degradation were further studied. The results were as follows: (1)There was a relationship between microspore cytological development and bud length of actractycodes japonica. It entered into the pollen mother cells period when the bud length reached 5 mm and the anther wall had already been divided. Then it was tetrad stage when it reached 7-9 mm. And it turned into the pollen grain period when it was longer than 11mm. (2)There are five anthers in one flower and there are four pollen sacs in every anther. Meiotic division of microsporocyte developed synchronously and the arrangement of microspores in the tetrad was mainly tetrahedral and it had 3 germinal furrows. (3)The development of anther wall follows the dicotyledonous type was composed of four layers, namely epidermis, endothecium, middle layer and tapetum from outside to inside,which belonged to glandular type. (4)The female flowers anther degradation ofA.japonicawas due to four reasons which were anther early developmental malformation, medicine wall differentiation abnormality, the microspore mother cells stop in meiosis prophase and cannot enter into tetrad stage and tapetum hyperplasia. This study provides the embryological basis for the phylogeny, speciation and evolution ofA.japonica.

Actractycodesjaponica, anther development, synantherous stamen, staminodium, male gametophyte

10.11931/guihaia.gxzw201505027

2015-12-26

2016-03-20

吉林省教育厅“十二五”规划项目(012015064)[Supported by the Education Department of Jilin Province, the “Twelfth Five Year Plan” Project(012015064)]。

具红光(1972-)，男(朝鲜族)，吉林舒兰人，博士，副教授，主要从事作物栽培育种研究，(E-mail)hgju@ybu.edu.cn。

朴锦，博士，副教授，主要从事中药材栽培及遗传育种，(E-mail)piaojin@ybu.edu.cn。

Q944，S567.21

A

1000-3142(2016)10-1259-06

具红光，全雪丽，崔馨月，等. 关苍术两性花与雌花花药的解剖学研究 [J]. 广西植物，2016，36(10):1259-1264

JU HG，QUAN XL，CUI XY，et al. Anatomical studies of hermaphrodite and female flower anther development ofActractycodesjaponica[J]. Guihaia，2016，36(10):1259-1264