淄博地区猪源产ESBL大肠杆菌的多重耐药分析

刘军河　李 娜　魏湘璎　（山东省淄博市动物卫生监督所　255000）

淄博地区猪源产ESBL大肠杆菌的多重耐药分析

刘军河李 娜魏湘璎（山东省淄博市动物卫生监督所255000）

为了解淄博地区猪源产ESBL大肠杆菌耐药特点，本研究于2016年4月对淄博地区3个养猪场采集猪粪便棉拭子，分离猪源产ESBL大肠杆菌，14种抗生素药敏片进行药敏检测。共收集236份猪粪便棉拭子样本，通过产ESBL确证试验获得94株产ESBL大肠杆菌，占猪源大肠杆菌的39.8%。所有产ESBL大肠杆菌菌株耐药性较强且呈现多重耐药，对碳青霉烯类药物敏感率较高。猪源产ESBL 大肠杆菌分离率高且耐药谱广，给临床中应用抗生素的治疗猪源大肠杆菌病带来很大的障碍。

猪源产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌耐药

临床上抗生素的大量使用，导致大肠杆菌耐药性越来越严重［1］。其中产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases， ESBLs）能够水解第一、二、三代头孢菌素及氨曲南，是细菌表现多重耐药的主要机制之一［2］。多重耐药菌的出现使临床上抗感染治疗更加困难［3］。

大肠杆菌病对幼畜或幼禽常造成严重的腹泻和败血症，对猪的危害表现在造成7日龄以内的仔猪黄痢、10日龄-1月龄的仔猪白痢和断奶前后的猪水肿病［4］。因此，了解猪源产ESBL大肠杆菌株的耐药谱，对临床上合理利用抗菌药物、增强抗感染治疗效果意义重大。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源2015年4月淄博地区三个养猪场采的不同日龄猪的肛门棉拭子。

1.1.2主要试剂伊红美蓝琼脂、麦康凯琼脂、Mueller-Hintion琼脂（MH），细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生物科技有限公司。

1.1.3药敏纸片头孢他啶（30µg/片）、头孢他啶/棒酸（10µg/片）、头孢噻肟（30µg/片）、头孢噻肟/棒酸（10µg/片）、复方新诺明（25µg/片）、氨苄西林（10µg/片）、氯霉素（30µg/片）、链霉素（10µg/片）、卡那霉素（30µg/片）、庆大霉素（10µg/片）、氟苯尼考（30µg/片）、阿莫西林（20µg/片）、头孢噻吩（30µg/片）、氨曲南（30µg/片）、环丙沙星（5µg/片）、四环素（30µg/片）均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1样品分离向猪粪便棉拭子离心管中加入500µL的生理盐水，混匀后，划线接种于含头孢噻肟的伊红美蓝培养基上，37℃培养18h。典型菌落接种于麦康凯培养基上，37℃培养18h。每个平板只挑取一个菌落。

1.2.2大肠杆菌的鉴定PCR扩增大肠杆菌16S rRNA保守区域。引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'［5］；PCR扩增产物克隆测序。

1.2.3产ESBL大肠杆菌的确证试验和药敏检测菌液调至0.5麦氏浊度，均匀涂布于M-H培养基上，分别贴头孢他啶、头孢他啶/棒酸、头孢噻肟、头孢噻肟/棒酸4个药敏纸片，37℃孵育18h后观察结果。根据CLSI2009标准，对产ESBL菌株表型确证判定。检测产 ESBL 阳性菌株对其余12种抗生素的敏感性。

2　结果

2.1猪场产ESBL大肠杆菌的分离从236份猪粪便棉拭子中共分离到94株耐头孢噻肟大肠杆菌，这94株菌均为产ESBL阳性，分离率为39.8%（附图）。

附图　产ESBL表型确证试验

附表　猪源产ESBL大肠杆菌菌株耐药率

2.2产ESBL大肠杆菌耐药性94株产ESBL大肠杆菌对很多抗生素均呈现高度耐药性，特别是对青霉素类和第代头孢菌素类抗生素如氨苄西林、头孢噻吩，以及三代的头孢噻肟均100%耐药，对阿莫西林的耐药率高达97.8%，95.7%的菌株对氨曲南表现耐药。但对碳青霉烯类抗菌药物均表现敏感（见附表）。

3　结论

（1）产超广谱β-内酰胺酶的菌株耐药谱广，自1983年首次报道后，在养殖动物和周围环境中检出率越来越高，给临床治疗用药带来极大的困难，并且对人类的健康产生威胁。本研究中采集淄博地区236份猪粪便棉拭子，经分离筛选共获得94株产ESBL大肠杆菌，分离率为39.8%，因此超广谱β-内酰胺酶已经普遍存在。（2）94株猪源产ESBL大肠杆菌对青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类的耐药性都非常高，耐药率近100%。对磺胺类和四环素类也具有高耐药性，高达96%左右。氨基糖苷类、喹诺酮类和氟喹诺酮类耐药率都在75%以上，所以这三类药物用于治疗大肠杆菌病的效果不佳。所有菌株都对碳青霉烯类抗菌药物表现敏感，这是由于我国禁止将碳青霉烯类药物应用于兽医临床。

总之，淄博地区猪源产ESBL大肠杆菌耐药谱广，均为多重耐药，大部分已经进化出了对新一代头孢类抗生素的耐药性，造成此类菌株形成临床感染治疗上、抗生素的选择将受到更大的限制。因此严格用药是控制细菌产生耐药性的重要方法；控制猪场的养殖环境卫生，加强对猪场养殖环境的监控，净化猪场水源和空气，为防止耐药菌株传播提供保障。

［1］ Amyes SGB， Gemmell CG. Antibiotic resistance. J Med Microbiol. 1997， 46∶ 436-470.

［2］ 孙长贵， 陈汉美. 超广谱β-内酰胺酶研究进展［J］. 国外抗生素分册，2000， 21（3）∶ 111-115.

［3］ 段玉平， 徐兴然， 曾忠良等. 猪源大肠杆菌整合子与耐药性的相关性研究［J］. 中国兽药杂志， 2009， 43（5）∶ 24-26.

［4］ 刘峰. 猪大肠杆菌病防治研究进展［J］. 湖南畜牧兽医， 2010， 6∶1-3.［5］ 杨滴， 王耀兵等. 粪便中大肠埃希菌的分离鉴定［J］. 微生物学杂志， 2007， 27（3）∶ 1-5.

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1007-1733（2016）10-0004-02

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