microRNA-365在骨肉瘤患者血浆中的表达及其意义

陆　斌， 李建武， 杨　艳

(中国人民武装警察部队陕西省总队医院骨科，西安　710054；*通讯作者，E-mail：lubin0008@163.com)



microRNA-365在骨肉瘤患者血浆中的表达及其意义

陆斌*， 李建武， 杨艳

(中国人民武装警察部队陕西省总队医院骨科，西安710054；*通讯作者，E-mail：lubin0008@163.com)

目的探讨microRNA-365(miR-365)在骨肉瘤患者血浆中的表达水平及其临床意义。方法采用定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)方法检测35例骨肉瘤患者和40例健康对照者血浆中miR-365的表达水平，并统计分析骨肉瘤患者血浆中miR-365表达水平与临床病理参数之间的关系。结果骨肉瘤患者血浆中miR-365表达水平为0.38±0.16，明显低于正常对照组血浆中miR-365的表达水平(0.61±0.24)，差异具有统计学意义(P<0.01)；骨肉瘤患者血浆中miR-365的表达水平在不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、病理类型及Enneking分期中差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-365在骨肉瘤患者血浆中的水平降低，miR-365可能参与骨肉瘤的发病。

microRNA-365；骨肉瘤；定量逆转录聚合酶链反应

骨肉瘤(osteosarcoma)是一种好发于儿童和青少年的骨骼系统的恶性肿瘤，起源于间叶组织，占恶性骨肿瘤的35%。由于骨肉瘤发展快、恶性程度高，骨肉瘤早期诊断及治疗较为困难[1-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)一种长度约22-24个碱基内源性表达的非编码单链小RNA，参与了早期发育、细胞增殖、分化及凋亡等生理过程。大量研究表明许多miRNAs可作为原癌基因或者抑癌基因在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用[6]，国内外研究证实多种miRNAs在骨肉瘤组织或细胞中异常表达，参与了骨肉瘤的病理过程[7-11]。国内学者研究发现miR-365可能通过调节KRAS基因表达来抑制骨肉瘤细胞SOSP9607增殖并促进其凋亡[12]，本实验为了进一步研究miR-365在骨肉瘤发病中的作用，利用定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miR-365在骨肉瘤患者血浆中的表达水平，并分析miR-365表达水平与临床病理参数之间的关系，以便为骨肉瘤的早期诊断提供新的理论依据和实验基础。

1　材料与方法

1.1研究对象

选取2012-01～2015-12在中国人民武装警察部队陕西省总队医院骨科住院且经过影像学及病理学确诊的骨肉瘤患者35例，其中男性20例，女性15例，年龄10-38岁(平均19.2±8.4岁)。Enneking分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期23例，Ⅲ期7例；骨肉瘤部位：股骨17例，胫骨13例，其他5例；瘤体大小：直径≤5 cm 23例，直径>5 cm 12例；参照Dahlin标准的组织学分型：骨母细胞型15例，软骨母细胞型9例，纤维母细胞型7例，其他4例。40例正常对照组为中国人民武装警察部队陕西省总队医院体检中心进行体检的健康人，其中男性23例，女性17例，年龄10-42岁，平均(21.3±9.5)岁。两组研究对象性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)、内参照U6(CD201-0145)及miR-365(CD201-0367)引物购自天根生化科技(北京)有限公司。紫外分光光度仪为美国Thermo Scientific公司产品，高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品，定量PCR仪为美国ABI公司产品。

1.2.2方法无菌采集所有研究对象EDTA抗凝外周静脉血5.0 ml，其中骨肉瘤患者在手术、放疗或化疗等抗肿瘤治疗前进行样本采集。血液分别经过3 000 r/min离心10 min、4 ℃ 12 000 r/min离心10 min后收集上层血浆置于EP管中-80 ℃保存待用。取200 μl血浆采用miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒提取RNA，操作严格按照试剂盒说明书进行。RNA溶于10 μl的DEPC水中，用紫外分光光度仪检测RNA溶液的浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8-2.1的RNA用于进行逆转录反应。利用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA合成，20 μl反应体系具体如下： RNA 2 μl、2×miRNA RT 反应缓冲液10 μl、miRNA 逆转录酶2 μl、无RNA酶水6 μl，逆转录反应条件：42 ℃ 60 min、95 ℃ 3 min，合成的cDNA反应液放置于-20 ℃保存待用。采用内参照U6(CD201-0145)及miR-365(CD201-0367)的引物进行PCR扩增，20 μl PCR反应体系包括：2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA 1 μl、50×ROX Reference Dye 2 μl、双蒸水6.2 μl，反应条件：95 ℃ 预变性15 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s 共40个循环。反应结束后获得溶解曲线及循环阈值(Ct值)，每个样本做3个复孔，采用2-ΔΔCt分析miR-365的表达水平。

1.3统计学处理

2　结果

2.1两组血浆中miR-365表达水平的比较

qRT-PCR检测血浆中miR-365的表达水平结果显示，骨肉瘤患者血浆中miR-365表达水平为0.38±0.16，明显低于正常对照组血浆中miR-365的表达水平(0.61±0.24)，二者差异具有统计学意义(t=3.899，P<0.01)。

2.2骨肉瘤患者血浆miR-365表达水平与临床病理参数之间的关系

根据qRT-PCR检测miR-365表达结果的中位值，将骨肉瘤患者分为低表达组(n=20)和高表达组(n=15)，统计学分析发现骨肉瘤患者血浆中miR-365的表达水平在不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、病理类型及Enneking分期中差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

3　讨论

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，好发于胫骨近端和股骨远端等长管状骨的干骺端，具有恶性程度高、侵袭能力强等特点。外科手术及放疗是目前主要的治疗方法，虽然随着医疗技术的不断提高，骨肉瘤患者的5年生存率有了大幅度提高，但由于早期容易发生肺转移及化疗药物耐药，骨肉瘤患者的总体预后较差[1-5]。目前骨肉瘤的诊断主要根据临床症状及影像学检查，缺乏临床检测指标以便早期诊断、评价预后，因此迫切需要寻找新的有效的骨肉瘤的早期诊断肿瘤标志物以进一步提高骨肉瘤的早期诊断和治疗水平。

表1骨肉瘤患者血浆中miR-365表达水平与临床病理参数的关系(例)

Table 1Relationships between plasma levels of miR-365 and clinical pathological parameters in patients with osteosarcoma(cases)

临床病 理指标 n低表达(n=20)高表达(n=15)χ2P年龄1.390.24 ≥16岁1486 <16岁21129性别0.060.81 男20119 女1596肿瘤部位1.050.59 股骨17116 胫骨1376 其他523肿瘤大小2.720.10 >5cm1275 ≤5cm231310病理类型0.760.86 骨母细胞型1587 软骨母细胞型954 纤维母细胞型752 其他422Enneking分期1.190.55 Ⅰ期523 Ⅱ期231310 Ⅲ期752

初级miRNA (primary miRNA)和前体miRNA (precursor miRNA，pre-miRNA)在 Drosha 复合体和 Dicer 酶的作用下在胞质中由剪切成为成熟miRNA，miRNA主要通过与靶基因 mRNA 的3′UTR结合导致靶基因降解或者抑制靶基因的表达，从而在转录后水平阻断靶基因的表达，进而发挥基因调节作用，参与调控发育、细胞增殖、凋亡、分化等多个生理过程，miRNA广泛存在真核生物中，具有组织特异性和时序性。大量研究发现miRNA在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用，扮演着“癌基因”和/或“抑癌基因”的重要角色[6]。国内学者采用miRNA芯片技术检测骨肉瘤组织和正常组织异常表达的miRNA，结果发现54个异常表达miRNA[13]，Lulla等[14]在骨肉瘤组织及细胞株中也发现22个miRNA差异表达。Namls等[15]采用定量PCR技术方法发现在骨肉瘤中103个miRNA表达上调，74个miRNA表达下调。此外多项研究分析发现多种miRNA表达水平与骨肉瘤的临床病理参数及预后密切相关[16-19]。

miR-365基因定位16p13.12，miR-365的功能非常复杂，在不同类型的肿瘤中可能发挥不同的作用。国内外学者利用miRNA芯片技术或定量PCR技术研究发现miR-365在结肠癌[20]、肺癌[21,22]、肝癌[23,24]、恶性黑色素瘤[25]、儿童白血病[26]及胃癌[27]等肿瘤组织或细胞系中表达下调。但有研究发现在浸润性导管胰腺癌[28]、皮肤鳞状细胞癌[29]中miR-365的表达水平增高，这也表明miR-365在不同肿瘤中可能发挥不同的作用。miRNA在外周血中由于包装机制而不易被RNA酶降解，可以非常稳定地存在，血液中miRNA的浓度较高，达到作为生物标记物的检测浓度，血浆或血清miRNA均可以用作生物标记物。我们前期研究发现骨肉瘤患者血浆中miR-181b水平增高，miR-181b可能参与了骨肉瘤的发病过程[19]。有学者利用qRT-PCR检测发现非小细胞肺患者血清中miR-365表达水平明显降低[30]。国内学者研究发现miR-365的模拟物可以抑制骨肉瘤细胞SOSP-9607的增殖，促进细胞凋亡，下调KRAS基因的表达；而miR-365的抑制物则可以促进细胞增殖，抑制凋亡，上调KRAS基因的表达[12]，提示miR-365可能通过调节KRAS基因的表达而发挥抑癌作用。我们利用qRT-PCR检测了骨肉瘤患者血浆中miR-365表达水平，结果发现骨肉瘤患者血浆中miR-365表达水平明显低于正常对照组(P<0.01)，提示miR-365可能参与骨肉瘤的发病。国内外研究还发现miR-365的表达水平与肿瘤的淋巴结转移、临床分期及预后有关[22-25]。我们也统计分析了骨肉瘤患者血浆中miR-365表达水平与临床病理参数的关系，结果发现骨肉瘤患者血浆中miR-365的表达水平在不同年龄、不同性别、不同肿瘤部位、不同肿瘤大小、不同病理类型及不同Enneking分期中差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与我们的病例数量较少有关，需要扩大样本量进一步研究，同时本研究缺乏随访，无法分析miR-365在骨肉瘤患者预后中的价值。

综上所述，骨肉瘤患者血浆miR-365中表达水平降低，提示miR-365可能参与了骨肉瘤的病理过程，但miR-365的作用机制及在骨肉瘤预后中的作用有待进一步研究，相信随着研究的不断深入miR-365有可能作为骨肉瘤的诊断标志物、预后及治疗靶标。

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Plasma levels of microRNA-365 in patients with osteosarcoma and its clinical significance

LU Bin*，LI Jianwu，YANG Yan

(DepartmentofOrthopaedics,ChinesePeople’sArmedPoliceTroopsShaanxiProvinceCorpsHospital,Xi’an710054,China;*Correspondingauthor,E-mail:lubin0008@163.com)

ObjectiveTo explore the plasma levels of microRNA-365(miR-365) and its clinical significance in patients with osteosarcoma.MethodsThe plasma levels of miR-365 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) in 35 patients with osteosarcoma and 40 healthy controls. The relationships between the plasma levels of miR-365 and clinical pathological parameters of osteosarcoma were analyzed.ResultsThe plasma levels of miR-365 in patients with osteosarcoma were statistically lower than in healthy controls(0.38±0.16vs0.61±0.24,P<0.01). There was no statistical difference in plasma levels of miR-365 in different age, gender, tumor site, tumor size, histological type and Enneking stage of patients with osteosarcoma(P>0.05).ConclusionThe plasma levels of miR-365 in patients with osteosarcoma decrease，which suggests that miR-365 may participate in the pathogenesis of osteosarcoma.

microRNA-365；osteosarcoma；quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

陕西省科技计划基金资助项目(2012k16-09-01)

陆斌，男，1975-09生，博士，副主任医师，E-mail:lubin0008@163.com

2016-07-26

R738.1

A

1007-6611(2016)10-0930-04DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.012