失功能高密度脂蛋白对冠心病患者血管新生的影响

李　芸, 曹德勇

(1延安大学附属医院心脑专科分院电生理室，延安　716000； 2延安大学附属医院心脑专科分院心血管内科一病区)



失功能高密度脂蛋白对冠心病患者血管新生的影响

李芸1, 曹德勇2

(1延安大学附属医院心脑专科分院电生理室，延安716000；2延安大学附属医院心脑专科分院心血管内科一病区)

目的研究冠状动脉粥样硬化性心脏病患者体内高密度脂蛋白对内皮细胞管状形成的影响。方法采用超高速梯度离心法提取正常志愿者(对照组)和冠状动脉粥样硬化性心脏病患者(实验组)体内的高密度脂蛋白，然后通过cell-free法检测两组高密度脂蛋白抗氧化能力的差异(用相对荧光强度RFU表示)，最后用Matrix gel法检测两组高密度脂蛋白对内皮细胞管状形成的影响(用血管条长度表示)。结果与对照组比较，实验组高密度脂蛋白的抗氧化能力明显降低(369.65±68.38vs1 017.60±116.52，P<0.05)；对照组高密度脂蛋白促进内皮细胞管状形成，实验组高密度脂蛋白可抑制内皮细胞管状形成；与对照组比较，实验组血管条长度变小(P<0.05)。结论冠状动脉粥样硬化性心脏病患者体内的失功能高密度脂蛋白可抑制内皮细胞管状形成。

冠状动脉粥样硬化性心脏病；高密度脂蛋白；内皮细胞；血管新生

高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)作为脂质和蛋白质组成的大分子复合物，能逆转运血液中的胆固醇至肝脏而降低血浆胆固醇含量而被认为具有预防心血管事件的作用，除此之外，正常HDL还具有抗炎、抗氧化、抗凝、保护内皮细胞、促进受损的内皮细胞愈合等作用， HDL被认为是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)的保护因子[1-5]。提高或维持血浆HDL水平也被大多数人认为是预防心血管疾病的有效途径之一。然而，多个关于应用胆固醇酯转移蛋白抑制剂(cholesteryl ester transfer protein inhibition，CETP)以提升机体HDL水平的多中心临床试验研究结果均提示单纯提高机体HDL水平并没有减少相应心血管事件的发生，相反还增加了高钾等不良事件的发生[5-10]。所有这些均提示真正起作用的不只是HDL水平的高低，可能HDL的质量(功能)才是其预防心血管疾病的核心所在。因此本研究从HDL的功能入手，检测CAHD患者与正常健康志愿者体内HDL在抗氧化能力和促进内皮细胞管状形成方面的差异，为将来确立HDL功能预防CAHD的研究核心提供科学依据。

1　资料与方法

1.1研究对象

CAHD组(实验组)为2015-06～2015-12就诊于延安大学附属医院心内科的CAHD患者共20例，年龄33-69岁，平均(42.36±9.37)岁，排除患有高血压、糖尿病、严重感染性疾病、肾功能衰竭等疾病的患者。对照组为来我院体检的20例健康志愿者,年龄30-55岁，平均(40.83±8.63)岁。所有参与者均签署知情同意书，本研究通过我院伦理委员会批准。

1.2血浆HDL提取

按文献[11]记录，采用超高速梯度离心法提取HDL：首先将空腹静脉血低温运送至实验室离心(4 ℃，4 000 r/min，10 min)，离心结束后将血浆移入预冷的超高速管(38 ml，Beckman coulter公司)内进行提取HDL。按比例向血浆加入1∶500 的EDTA(134 mmol/L)和1∶10 000 的BHT(200 mmol/L)并混匀后离心(4 ℃，50 000 r/min，21 h)。离心结束后，血浆成分会因浓度差异而分为5层，由上至下依次：乳糜颗粒(Chylomicron，CM，乳白色)、水、低密度脂蛋白(LDL，浅橘黄色)、高密度脂蛋白(HDL，亮绿色)、杂质(深橘黄色)。仔细吸取HDL上面的CM、水及LDL并弃去，然后用无菌注射器将HDL层面吸出并用0.22 μm的滤器(Merk Millipore公司)过滤到到新的超高速离心管内；按文献[11]将上一步提取的HDL的浓度调整为1.063 g/ml并将体积补足至38 ml后再次离心(4 ℃ 50 000 r/min 21 h)。离心结束后，血浆成分会因浓度差异而分为4层，由上至下依次：LDL(浅橘黄色)、1.063密度液、HDL(亮绿色)、杂质(深橘黄色)。仔细吸取HDL上面的LDL、1.063密度液并弃去，然后用无菌注射器将HDL层面吸出并用0.22 μm的滤器过滤到新的超高速离心管内；按文献[11]将上一步提取的HDL的浓度调整为1.21并将体积补足38 ml后再次离心(4 ℃ 50 000 r/min 21 h)。离心结束后，血浆成分会因浓度差异而分为3层，由上至下依次为HDL(亮绿色)、1.21密度液、杂质(深橘黄色)。仔细吸取HDL层面后过滤，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific 公司)测定HDL蛋白浓度后放4℃冰箱备用(提好的HDL可4 ℃储存3周)。

1.3HDL抗氧化能力检测

按文献[12]报道，采用cell-free法来检测HDL的抗氧化能力：向等质量的对照组和实验组HDL中加入CuCl2(21.7 μmol/L，Sigma公司)10 μl孵育1 h，期间用甲醇(Sigma公司)将Dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA，Calbiochem公司)配制为2.0 mg/ml的溶液并置暗处室温静置30 min后取10 μl加入孵育过CuCl2的HDL中(注意避光)继续孵育30 min后置入酶标仪(Spectra Max,Gemini XS;Molecular Devices，美国Molecular Devices)内连续读数12 h读取各组HDL的相对荧光强度值(relative fluorescence units，RFU)，理论上抗氧化能力弱的HDL具有较高RFU值。

1.4HDL对内皮细胞管状形成的影响

将预冷的DMEM(Gibco公司)与Matrix gel(BD Biosciences公司)等体积混匀后加入预冷的48孔板内，每孔150 μl，轻轻震荡孔板后放入培养箱至少20 min使其凝固。Matrix gel凝固过程中将4代脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs，ScienCell公司)用37 ℃的胰酶酶解后用等体积内皮细胞培养基(ECM，ScienCell公司)中和胰酶对细胞的进一步酶解后离心(25 ℃，800 r/min，5 min)，弃去上清后将细胞充分吹打混匀于ECM中，最终将细胞密度调至(2-3)×105个/ml，然后将300 μl细胞加入凝固完成的Matrix gel。研究分别设计空白组(不做任何处理)、阳性对照组(加入血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF，R&D公司，50 ng/ml)、对照组(加入对照组HDL，100 μg/ml)、实验组(加入实验组HDL，100 μg/ml)。将48孔板轻微震荡混匀后放入培养箱孵育12 h。12 h后将孔板拿到显微镜(Olympus公司)下拍照(放大倍数：10×10，无需特殊染色)，拍照结果用NIH Image J software统计分析各组血管条形成的长度(将所要分析的图片均分为49宫格，通过计数含有血管条的宫格数进行统计分析)。

1.5统计学方法

2　结果

2.1一般临床数据

冠状动脉粥样硬化性心脏病患者(冠心病组)和健康志愿者(对照组)在年龄、性别、体重指数上无明显统计学差异，但冠心病组血脂水平普遍较对照组偏高(见表1)。

表1实验组和对照组患者临床资料

Table 1Clinical data of CAHD patients and healthy controls

组别n年龄(岁)男/女胆固醇(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)高密度脂蛋白(mmol/L)低密度脂蛋白(mmol/L)体质量指数(kg/m2)冠心病组2042.36±9.3710/106.86±0.972.58±0.960.89±0.424.58±0.9122.67±0.86对照组2040.83±8.6311/94.23±0.821.14±0.421.17±0.613.25±0.8721.53±0.54 P0.1810.5720.0010.0000.0000.0010.358

2.2HDL抗氧化能力的检测

与对照组比较，冠心病组HDL相对荧光强度明显升高(369.65±68.38vs1017.60±116.52，P<0.05，见图1)，提示冠心病组HDL抗氧化能力明显减弱。

2.3HDL对内皮细胞管状形成的影响

显微镜下可见，与空白组比较，对照组HDL和阳性对照组均可以促进内皮细胞管状形成，冠心病组HDL对内皮细胞管状形成没有促进作用(见图2)。图片数据转换为数值后可见，与阳性对照组和对照组HDL比较，实验组的血管条长度变小(P<0.05，见图3)。

与对照组比较,*P<0.05　图1　两组HDL抗氧化能力的比较　Figure 1　Comparison of the antioxidant capacity between two groups

图2　HDL对内皮细胞管状形成的影响 (10×10)Figure 2　Effect of HDL on the tube formation of endothelial cells in two groups (10×10)

与空白组比较，*P<0.05；与阳性对照组和对照组比较，#P<0.05　图3　HDL对内皮细胞血管条长度的影响　Figure 3　Effect of HDL on the vessel length of endothelial cells in two groups

3　讨论

本研究通过超高速梯度离心提取CAHD患者和健康志愿者的HDL，并检测两种HDL在抗氧化能力和促进内皮细胞管状形成上的差异发现：与对照组HDL比较，实验组HDL抗氧化能力及促进内皮细胞管状形成的能力均减弱，一定程度证明了HDL的“质量”比“数量”能更有力地影响了心血管疾病的进展和预后。

心肌缺血和心肌梗死危及无数患者生命，但是目前临床仍没有促进心肌缺血后血管新生的有效方法。究其根源主要是影响血管新生的真正机制到目前为止仍未研究清楚。1977年伯明翰心脏研究中心(The Framingham Heart Study)证实HDL与CAHD的发生呈负相关(独立相关因素)[13]，HDL便广受关注，而且这一观点也被越来越多的研究机构和团体所证实和认可[14,15]。进一步的深入研究发现HDL主要通过以下几个方面发挥其保护心血管作用：逆向转运血液中的胆固醇进入肝脏进行分解代谢、抗炎、抗氧化、抗凝、清除或减轻氧化甾醇和磷脂对机体的毒害作用、保护内皮细胞、促进受损内皮细胞的修复及促进血管新生等[3,5]。本研究也显示正常健康志愿者体内的HDL(对照组HDL)可以促进内皮细胞管状形成。

鉴于HDL的上述功效，提升HDL水平可以预防CAHD发生和改善其预后这一理论是可行的。但是，不仅近年的临床随机对照试验，而且过去在动物实验中可以有效促进心肌缺血或梗死后血管新生的方法或药物(如生长因子)在应用到临床病人中时并不能达到预期的效果[16-21]。最近多中心临床随机对照研究发现，将胆甾醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)抑制剂torcetrapib(托彻普)或dalcetrapib((达塞曲匹)应用于CAHD患者虽然有效提高了血浆HDL水平，但是并没有减少相应的心血管并发症及预后，甚至还出现一些额外的风险[6,10]。经过对以往文献研究发现：过去报道的血管新生成功实验案例均是用正常动物建立心肌缺血或心肌梗死模型，然后应用各种生长因子进行治疗的[22-24]，然而临床上心肌缺血或梗死患者大多数是高脂血症导致动脉粥样硬化引起的，据此我们有理由推测高脂血症时机体的某些成分或高脂血症使机体内某些物质的改变可能是抑制血管新生的真正原因所在。Mora等[25]最近的研究显示，他汀治疗前后人体HDL组成成分发生明显改变，因此HDL功能学的检测较血浆含量检测更为有意义。单纯HDL数量上的改变无法左右CAHD的进展和预后。Denimal等[26]的研究也发现，糖尿病患者体内的HDL水平虽然正常，但其功能已经受到损害。本研究通过对比对照组HDL和实验组HDL发现：实验组HDL抗氧化能力较对照组HDL明显减弱，且实验组HDL也丧失了促进内皮细胞管状形成的能力。提示HDL功能正常是发挥心血管保护作用的前提。但是仍需深入的研究以进一步明确其分子生物学机制。

综上所述, 本研究显示冠状动脉粥样硬化性心脏病患者体内的失功能HDL抑制内皮细胞管状形成，一定程度上解释了单纯升高HDL含量无法改善冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的预后，为将来将HDL功能作为研究靶标提供理论依据。

[1]Toth PP,Davidson MH.High-density lipoproteins:marker of cardiovascular risk and therapeutic target[J].J Clin Lipidol,2010,49(5):359-364.

[2]Tall AR.Cholesterol efflux pathways and other potential mechanisms involved in the athero-protective effect of high density lipoproteins[J].J Intern Med,2008,263(3):256-273.

[3]Zhang Q,Yin H,Liu P,etal.Essential role of HDL on endothelial progenitor cell proliferation with PI3K/Akt/cyclin D1 as the signal pathway[J].Exp Biol Med(Maywood),2010,235(9):1082-1092.

[4]van Lenten BJ,Wagner AC,Jung CL,etal.Anti-inflammatory apo A-I mimetic peptides bind oxidized lipids with much higher affinity than human apoA-I[J].J Lipid Res,2008,49(11):2302-2311.

[5]Smythies LE,White CR,Maheshwari A,etal.Apolipoprotein A-I mimetic 4F alters the function of human monocyte-derived macrophages[J].Am J Physiol,2010,298(6):C1538-C1548.

[6]Bots ML,Visseren FL,Evans GW,etal.Torcetrapib and carotid intima-media thickness in mixed dyslipidaemia(RADIANCE 2 study):a randomised,double-blind trial[J].Lancet,2007,370(9582):153-160.

[7]Kastelein JJ,van Leuven SI,Burgess L,etal.Effect of torcetrapib on carotid atherosclerosis in familial hypercholesterolemia[J].N Engl J Med,2007,356(16):1620-1630.

[8]Nicholls SJ,Tuzcu EM,Brennan DM,etal.Cholesteryl ester transfer protein inhibition,high-density lipoprotein raising,and progression of coronary atherosclerosis:insights from ILLUSTRATE(Investigation of Lipid Level Management Using Coronary Ultrasound to Assess Reduction of Atherosclerosis by CETP Inhibition and HDL Elevation)[J].Circulation,2008,118(24):2506-2514.

[9]Nissen SE,Tardif JC,Nicholls SJ,etal.Effect of torcetrapib on the progression of coronary atherosclerosis[J].N Engl J Med,2007,356(13):1304-1316.

[10]Schwartz GG,Olsson AG,Abt M,etal.Effects of dalcetrapib in patients with a recent acute coronary syndrome[J].N Engl J Med,2012,367(22):2089-2099.

[11]Mendez AJ,Oram JF,Bierman EL.Protein kinase C as a mediator of high density lipoprotein receptor-dependent efflux of intracellular cholesterol[J].J Biol Chem,1991,266(16):10104-10111.

[12]Ou J,Wang J,Xu H,etal.Effects of D-4F on vasodilation and vessel wall thickness in hypercholesterolemic LDL receptor-null and LDL receptor/apolipoprotein A-I double-knockout mice on western diet[J].Circ Res,2005,97(11):1190-1197.

[13]Gordon T,Castelli WP,Hjortland MC,etal.High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease.The Framingham Study[J].Am J Med,1977,62(5):707-714.

[14]Huxley RR,Barzi F,Lam TH.Isolated low levels of high-density lipoprotein cholesterol are associated with an increased risk of coronary heart disease:an individual participant data meta-analysis of 23 studies in the Asia Pacific region[J].Circulation,2011,124(19):2056-64.

[15]Wilson PW.High-density lipoprotein,low-density lipoprotein and coronary artery disease[J].Am J Cardiol,1990,66(6):7A-10A.

[16]Simons M,Annex BH,Laham RJ,etal.Pharmacological treatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor-2:double-blind,randomized,controlled clinical trial[J].Circulation,2002,105(7):788-793.

[17]Henry TD,Annex BH,McKendall GR,etal.The VIVA trial:vascular endothelial growth factor in ischemia for vascular angiogenesis[J].Circulation,2003,107(107):1359-1365.

[18]Kastrup J,Jorgensen E,Ruck A,etal.Direct intramyocardial plasmid vascular endothelial growth factor-A165 gene therapy in patients with stable severe angina pectoris A randomized double-blind placebo-controlled study:the Euroinject One trial[J].J Am Coll Cardiol,2005,45(7):982-988.

[19]Ripa RS,Wang Y,Jorgensen E,etal.Intramyocardial injection of vascular endothelial growth factor-A165 plasmid followed by granulocyte-colony stimulating factor to induce angiogenesis in patients with severe chronic ischaemic heart disease[J].Eur Heart J,2006,27(15):1785-1792.

[20]Stewart DJ,Kutryk MJ,Fitchett D,etal.VEGF gene therapy fails to improve perfusion of ischemic myocardium in patients with advanced coronary disease:results of the Northern trial[J].Mol Ther,2009,17(6):1109-1115.

[21]Kukula K,Chojnowska L,Dabrowski M,etal.Intramyocardial plasmid-encoding human vascular endothelial growth factor A165/basic fibroblast growth factor therapy using percutaneous transcatheter approach in patients with refractory coronary artery disease(VIF-CAD)[J].Am Heart J,2011,161(3):581-589.

[22]Harada K,Grossman W,Friedman M,etal.Basic fibroblast growth factor improves myocardial function in chronically ischemic porcine hearts[J].J Clin Invest,1994,94(2):623-630.

[23]Schalch P,Rahman GF,Patejunas G,etal.Adenoviral-mediated transfer of vascular endothelial growth factor 121 cDNA enhances myocardial perfusion and exercise performance in the nonischemic state[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2004,127(127):535-540.

[24]Toyota E,Warltier DC,Brock T,etal.Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat[J].Circulation,2005,112(14):2108-2113.

[25]Mora S1,Glynn RJ,Ridker PM.High-density lipoprotein cholesterol,size,particle number,and residual vascular risk after potent statin therapy[J].Circulation,2013,128(11):1189-1197.

[26]Denimal D,Pais de Barros JP,Petit JM,etal.Significant abnormalities of the HDL phosphosphingolipidome in type 1 diabetes despite normal HDL cholesterol concentration[J].Atherosclerosis,2015,241(2):752-60.

Effect of dysfunctional high density lipoprotein on angiogenesis in patients with coronary atherosclerotic heart disease

LI Yun1, CAO Deyong2

(1DepartmentofElectrophysiology,CardiovascularSpecialistBranch,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofCardiology,CardiovascularSpecialistBranch,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity)

ObjectiveTo explore the effect of high density lipoprotein(HDL) on the tube formation in patients with coronary atherosclerotic heart disease(CAHD).MethodsUltra high speed gradient centrifugation was used to centrifuge HDL from normal volunteers(control group,n=20) and CAHD patients(CAHD group,n=20).Then the difference of antioxidant capacity of HDL between two groups was detected by cell-free assay. The gel matrix assay was applied to detect the endothelial cell tube formation.ResultsCompared with control group, antioxidant capacity of HDL in CAHD group was significantly reduced(369.65±68.38vs1 017.60±116.52，P<0.05). The endothelial cell tube formation was increased by HDL in control group but decreased in CAHD group. The length of vessel was shorter in CAHD group than in control group(P<0.05).ConclusionThe dysfunctional HDL in CAHD patients may inhibit the endothelial cell tube formation, which may partly explain why simple elevation of HDL levels can not improve the prognosis of patients with CAHD.

coronary atherosclerotic heart disease;high density lipoprotein;endothelial cell;angiogenesis

国家自然科学基金资助项目(81341112)

李芸，女，1979-02生，本科，主治医师

2016-06-22

R541.4

A

1007-6611(2016)10-0909-05DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.007