响应面法优化商洛核桃青皮多糖提取工艺

何念武，丁淑平，李堆淑，赵艳艳

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)



响应面法优化商洛核桃青皮多糖提取工艺

何念武，丁淑平，李堆淑，赵艳艳

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

为探究商洛核桃青皮多糖热水浸提的最佳工艺条件，以多糖提取率为响应值，在单因素实验基础上，以液料比、提取时间、提取温度为考察因素，采用响应面法(RSM)建立数学模型，筛选最佳提取工艺。研究结果表明，商洛核桃青皮多糖最佳提取条件为：液料比30∶1，浸提时间2.5 h，提取温度90 ℃，在此条件下多糖提取率可达到7.01%。各因素对提取率影响的大小顺序为：提取温度>提取时间>液料比。此工艺合理可行，可用于商洛核桃青皮多糖的提取。

商洛核桃青皮；多糖；响应面法；工艺优化

核桃青皮，又名青龙衣，为胡桃科植物胡桃楸(JuglansmandshuricaM.)和胡桃(JuglansregialL.)的未成熟果实的绿色外果皮，主产于东北、山东、河北等地[1]，自古以来一直作为民间常用中药材，辛、苦、涩、平，有清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢等广泛的药用价值[2]。研究表明，青龙衣有效成分对于人类的健康保护以及抗微生物活性方面有着重要的作用[3-4]。多糖作为核桃青皮主要化学成分之一，对其进行深入研究具有重要意义。此外，有研究表明多糖都具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗肿瘤等诸多功效[5-6]，这对深度开发商洛核桃青皮多糖是一个很好的启发。然而，近年来国内外学者对核桃青皮的探索主要集中在胡桃醌、多酚类等化学成分的分离制备以及药理活性研究等方面[7-10]。

核桃青皮为核桃外部一层厚厚的绿色果皮，核桃果实采摘后脱掉的青皮堆放在田间地头或倾倒在河里，不仅会造成资源的浪费，还会给生态环境带来严重的污染[2,4]。如果对核桃青皮中的有效物质加以提取、分离、综合利用，既可以保护环境，还可以增加果农收入[2,4]。为此，本文采用响应面法对商洛核桃青皮多糖的提取工艺进行优化，旨在为下一步商洛核桃青皮多糖活性机制研究及进一步开发利用商洛核桃青皮资源奠定基础和提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

商洛核桃青皮，2014年8～9月采自商洛洛南县寺坡中山，经商洛学院张小斌教授鉴定为胡桃科植物胡桃楸(JuglansmandshuricaM.)的未成熟果实的外果皮。洗净，晒干至恒重备用。

1.2商洛核桃青皮多糖的提取与精制

将干燥的核桃青皮粉碎过100目筛，精密称取20 g，按一定液料比在热水中浸提数小时。提取结束后4000 r/min离心10 min，沉淀再加水重复浸提两次，而后离心，合并上清液。pH调为6.0后，加入2%活性炭脱色30 min。在60 ℃条件下减压浓缩至200 mL左右。加入4倍体积的无水乙醇，充分搅拌后置于4 ℃冰箱沉淀12 h，然后4000 r/min离心10 min，重复操作3次，每次均采用离心分离上清液与沉淀。回收上清液中的乙醇，沉淀加水配成一定体积的多糖水溶液，Sevage法除蛋白处理4次。将去蛋白的多糖提取液透析48 h，每8 h换一次水。浓缩透析袋内的多糖液至黏稠，以乙酸乙酯、氯仿反复交叉洗之，最后以氯仿洗之。置鼓风干燥箱中干燥(40 ℃)，得精制商洛核桃青皮多糖。以下述公式计算多糖提取率：

多糖提取率(%)=多糖干品质量/商洛核桃青皮粉末质量×100%。

1.3多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。精确吸取葡萄糖标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至50 mL。以上不同质量浓度溶液各取1.0 mL，分别加入质量分数为5%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀。然后迅速加入浓硫酸3.0 mL，立即摇匀。置于95 ℃水中恒温加热30 min，取出冷却至室温，于490 nm处测吸光度(A)值。以葡萄糖浓度为横坐标，以对应吸光值为纵坐标，绘制标准曲线(图1)，得回归方程为：y=0.0505x+0.0056，R2=0.9988(n=8)。从图中可以看出，在10～80 μg/mL质量浓度范围内葡萄糖浓度与吸光度呈良好的线性关系。

图1　葡萄糖标准曲线

1.4单因素实验

用水提醇沉法提取商洛核桃青皮中的水溶性多糖，深入研究液料比、浸提时间、浸提温度等因素对多糖提取率的影响。

液料比：分别称取60 g的商洛核桃青皮粉末，按液料体积质量比5∶ 1、10∶ 1、15∶ 1、20∶ 1、25∶ 1、30∶ 1，加入蒸馏水。80 ℃水浴浸提2.5 h，4000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液。依法提取3次，合并上清液。

时间：分别称取60 g商洛核桃青皮粉末, 液料比为30∶ 1，在80 ℃水浴中分别浸提1、2、3、4、5 h, 离心后弃沉淀收集上清液。依法提取3次，合并上清液。

温度：分别称取60 g商洛核桃青皮粉末，液料比为30∶ 1，分别置于50、60、70、80、90 ℃恒温水浴锅中，浸提2.5 h，离心后弃沉淀收集上清液。依法提取3次，合并上清液。

1.5响应曲面优化设计实验

依据单因素实验结果，选择液料比、浸提时间、浸提温度为试验因素，根据Box-Behnken设计，进行三因素三水平的响应面分析实验，以商洛核桃青皮多糖得率为响应值，利用Design-Expert 8.05b实验设计软件对实验数据进行分析，因素水平设计见表1。

表1　响应面分析因素及水平

2　结果与分析

2.1单因素实验结果分析

2.1.1液料比对商洛核桃青皮多糖提取率的影响从图2可以看出，液料比从5∶1增加到30∶1时，多糖提取率显著增加；液料比增加到20∶1后，多糖提取率增幅放缓。这可能是随着液料比的不断扩大，核桃青皮中残留的多糖成分越来越少的缘故。这与何念武等[11]的研究结论一致。

图2　液料比对商洛核桃青皮多糖提取率的影响

2.1.2浸提时间对商洛核桃青皮多糖提取率的影响由图3可知，提取时间对商洛核桃青皮多糖提取率的影响先是快速增长而后趋于平缓。多糖提取率在3 h后趋于平缓的原因可能是：随着提取时间的不断延长，商洛核桃青皮中的多糖成分大部分已经被浸提出来，商洛核桃青皮中固有的多糖成分越来越少。为减少能耗，节省时间，选择提取时间为3 h。

图3　提取时间对商洛核桃青皮多糖提取率的影响

2.1.3浸提温度对商洛核桃青皮多糖提取率的影响由图4可知，提取温度在50～80 ℃之间，多糖的提取率随着温度的升高呈快速递增趋势；从80～90 ℃，提取率缓慢降低。这可能是由于温度过高，从商洛核桃青皮中提取的多糖有所降解，使提取率下降。因此选择浸提温度为80 ℃。

图4　提取温度对商洛核桃青皮多糖提取率的影响

2.2响应面分析

2.2.1响应面实验结果的方差分析和显著性检验在单因素实验的基础上，以A=(Z1-25)/5，B=(Z2-3)/0.5，C=(Z3-80)/10为自变量，以多糖提取率Y为响应值，进行响应面分析实验，实验结果见表2。

应用统计分析软件Design-Expert 8.05b对数据进行分析，回归分析结果见表3，回归方程为：Y=5.17+0.16A+0.3B+0.83C-0.00375AB-0.15AC+0.34BC+0.22A2-0.23B2+0.38C2。

当P值小于0.05时，即表示该项指标显著。从表3中可以得出，本实验的模型显著(P=0.0035)，失拟项不显著(P=0.3814)，说明该模型是合理的。由P值可知，各因素对提取率影响的大小顺序为：提取温度>提取时间>液料比，其中，B、C、BC、C2对Y的影响显著，A对Y的影响不显著。回归模拟的R2为0.9665，说明模型的拟合程度很好，响应值的96.65%是由所选变量即液料比、提取时间、提取温度引起的，故可以用来分析和预测商洛核桃青皮多糖的提取率。

2.2.2响应面分析液料比(A)与提取时间(B)对商洛核桃青皮多糖提取率影响的响应面曲线结果如图5所示。从图5中可以看出，液料比与浸提时间之间的交互作用不显著，这与方差分析结论一致。整个响应曲线成凸形，说明商洛核桃青皮多糖提取率可达到最大值。

表2　响应面实验设计方案及实验结果

表3　商洛核桃青皮多糖提取率的回归方差分析

图5　液料比与提取时间对多糖提取率影响的响应面曲线3D图

由图6可知，当提取时间为2.5 h时，液料比在较大范围内均可以得到较大的响应值Y；浸提温度编码在0.55～1时，核桃青皮多糖得率可达到最大值。这与方差分析结果相吻合。

图6　液料比与提取温度对多糖提取率影响的响应面曲线3D图

由图7可知，当液料比取30∶ 1时，浸提时间与浸提温度之间的交互作用显著；当浸提时间编码在0.25～1，浸提温度编码在0.8～1时，多糖得率可达到最大值。

图7　提取时间与提取温度对多糖提取率影响的响应面曲线3D图

2.2.3验证实验由响应面预测模型得出的最优工艺条件为：液料比为30∶ 1，提取时间为2.5 h，提取温度为80 ℃，预测多糖的提取率为6.92%。为了验证由响应面预测分析的最优条件，采用上述条件进行3次验证实验，实际测得多糖提取率平均值为7.01%，与模型预测值接近。因此，采用响应面法优化商洛核桃青皮多糖的得率有一定的实际意义，对现实生产具有一定的参考价值。

3　结论

本文在单因素实验的基础上，将响应面法应用于优化商洛核桃青皮多糖的提取工艺，得出最佳工艺条件：液料比为30∶1，提取时间为2.5 h，提取温度为80 ℃。在此条件下，多糖预测得率为6.99%，而实际实验测定值为7.01%±0.22%，此条件下实验值与预测值非常接近，说明该预测模型比较可靠，可以为商洛核桃青皮多糖的大规模生产提供理论依据。另外，研究发现提取时间、提取温度、提取时间与提取温度的交互项，以及提取温度的二次项对多糖提取率的影响显著，说明液料比、提取时间和提取温度对商洛核桃青皮多糖提取率的影响不是简单的线性关系。各因素对提取率影响的大小顺序为：提取温度>提取时间>液料比。

[1] 仲军梅,刘玉梅.核桃青皮的开发利用研究进展[J].食品工业科技,2014,35(19):396-400.

[2] 王红萍,尹江艳.核桃青皮的有效成分及综合利用[J].安徽农业科学,2013,41(24):10129-10132.

[3] 王晓泊,张翠,刘颖.青龙衣的药用研究概述[J].上海医药,2007,28(3):120-122.

[4] 赵岩,刘淑萍,吕朝霞.核桃青皮的化学成分与综合利用[J].农产品加工,2008(11):66-68.

[5] Oliveira I, Anabela S, Isabel C F R, et al. Total phenols, antioxidant potential and antimicrobial activity of walnut (JuglansregiaL.) green husks[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(7): 2326-2331.

[6] 何念武,高一明.商南泉茗茶多糖的体外抗肿瘤活性[J].商洛学院学报,2015,29(4):51-56.

[7] 王全杰,李超,王纯,等.核桃青皮中单宁的类型及含量测定[J].皮革与化工,2011,28(3):25-27.

[8] 张雪春,王振兴,金波,等.核桃外果皮色素的特性分析[J].南方农业学报,2014,45(8):1462-1465.

[9] Kamran G, Yousef G, Abdollah E, et al. Influence of environmental factors on antioxidant activity, phenol and flavonoids contents of walnut(JuglansregiaL.) green husks[J]. Medicinal Plants Research, 2011, 5(7): 1128-1133.

[10] 张鹤华,薛进军,侯延杰,等.乙烯利和萘乙酸输液滴干对核桃青皮开裂率及果实品质的影响[J].南方农业学报,2015,46(6):1058-1062.

[11] 何念武.水提醇沉法制备商南泉茗茶茶多糖的研究[J].商洛学院学报,2013,27(6):78-81.

(责任编辑：许晶晶)

Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Shangluo Walnut Green Peel by Response Surface Method

HE Nian-wu, DING Shu-ping, LI Dui-shu, ZHAO Yan-yan

(College of Biopharmaceutical and Food Engineering, Shangluo University, Shangluo 726000, China)

In order to explore the optimum process conditions for the hot-water extraction of polysaccharide from Shangluo walnut green peel, the author took polysaccharide extraction rate as response value, took water-material ratio, extraction time and extraction temperature as investigated factors, used response surface method (RSM) to establish a mathematical model based on the results of single-factor experiments, and screened out the best polysaccharide extraction conditions as follows: water-material ratio 30∶1, extraction time 2.5 h, and extraction temperature 90 ℃. Under these conditions, the polysaccharide extraction rate could reach 7.01%. The influence of various factors on polysaccharide extraction rate showed the following order: extraction temperature > extraction time > water-material ratio. This process is reasonable and feasible, and it can be used for the extraction of polysaccharide from Shangluo walnut green peel.

Shangluo walnut green peel; Polysaccharide; Response surface method; Process optimization

2016-05-03

陕西省教育厅专项科研计划项目“商洛核桃青皮提取物防治烟草病虫害关键技术研究” (15JK1219)；商洛市烟草公司横向科研项目“核桃青皮提取物防治烟草病毒病关键技术研究”(KJ-2014-02)。

何念武(1985─)，男，陕西商洛人，讲师，硕士研究生，主要从事中药材成分分析及活性研究。

S664.1

A

1001-8581(2016)10-0056-04