正交法优选杜仲叶中绿原酸提取工艺

◎张 蕾，张 娜，展雯琳

（陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000）

正交法优选杜仲叶中绿原酸提取工艺

◎张 蕾，张 娜，展雯琳

（陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000）

为优选杜仲叶中绿原酸的最佳提取工艺，选取乙醇浓度、料液比、超声波时间、浸泡时间等为影响因素，先通过单因素试验提取绿原酸，然后通过正交试验法优化提取参数。结果最佳提取条件：乙醇浓度40%，料液比1∶35，超声波时间30 min，浸泡时间60 min，此条件下绿原酸的得率为8.041 8 mg/g。结论杜仲叶中富含绿原酸，优化杜仲叶中绿原酸提取工艺，可为绿原酸的开发和应用提供理论依据。

杜仲叶；绿原酸；提取；工艺

杜仲（Eucommia ulmoides）［1］是中国名贵滋补药材，现代药理研究表明，杜仲叶具有降压、调节血脂、心血管保护、预防肥胖、抗炎、抗病毒、增强免疫、延缓衰老和抗疲劳等作用。临床上杜仲叶主要应用于降压、治疗妇产科疾病等。

绿原酸［2］的又名咖啡鞣酸、咖啡单宁酸，化学名3-O-咖啡酰奎尼酸，是一种弱极性分子，25 ℃时在水中的溶解度约为4%，易溶于醇和丙酮，微溶于乙酸乙酯，在热水中溶解度较大。近年来，研究证明绿原酸具有广泛的药理作用，如抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝作用、抗内毒素等［3］。杜仲叶绿原酸含量丰富，可达1%～5%［4］，因此优化杜仲叶中绿原酸提取工艺，对生产生活及绿原酸今后衍生产品的开发和应用都具有重要的意义。本文先通过单因素试验提取绿原酸，然后通过正交试验法优化提取参数，以期为进一步扩展杜仲叶中绿原酸的研究范畴提供参考性数据。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：杜仲叶（汉中本地收集）、绿原酸标准品、无水乙醇、氢氧化钙、氢氧化钠、浓硫酸，试剂均为分析纯。

仪器：760CRT双光束紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂；WGLL-230BE电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；植物草本粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；标准检验筛，浙江上虞市道墟张兴纱筛厂；BSA224S-CW电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；旋片式真空泵，上海沪冈真空泵制造有限公司；KQ3200E型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；LD5-10低速离心机，北京京立离心机有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绿原酸标准曲线绘制

用天平准确称取绿原酸标准品0.001 g，用50%乙醇溶液溶解定容于100 mL的质量浓度为0.01 mg/mL标准液。取1 mL于10 mL的容量瓶中，50%乙醇溶液定容至刻度。以50%乙醇溶液为参比，用紫外可见分光光度计在250～450 nm处扫描，结果如图1所示，得最大吸收波长为334.9 nm。

图1 绿原酸标准品紫外吸收光谱图

分别准确量取上述0.01 mg/mL的标准液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL和10 mL于10 mL容量瓶中，50%乙醇溶液定容至刻度，以空白试剂为对照，在334.9 nm波长处测定吸光度，以绿原酸质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

图2 绿原酸标准品曲线图

得回归方程：Y=0.012 73X+0.003 5，R2=0.999 5。可见，绿原酸在所测量的范围内呈现良好的线性关系。

1.2.2 绿原酸的粗提

将杜仲叶洗净，摊开放入烘箱50 ℃烘干，于粉碎机中粉碎成粉末并过80目筛，收集、封存，备用。称取0.5 g粉末在料液比1∶30、乙醇浓度50%、浸提时间6 min、超声波时间30 min下浸提抽滤，即得绿原酸粗提液。

1.2.3 绿原酸的精制

将上步所得绿原酸的粗提液定容至15 mL，取5 mL 加20%石灰乳调节pH=12，过滤，滤渣加2倍体积乙醇混悬，过滤，滤液加50%硫酸调节pH为3～4，过滤，滤液加20%氢氧化钠调节pH=7，过滤，滤液3 000 r/min离心10 min，定容至15 mL在最大吸收波长下测其吸光度。

1.2.4 绿原酸得率计算方法

式中Y：绿原酸得率mg/g；A：吸光度；N：稀释倍数；V：绿原酸滤液体积，mL；m：金银花原料的质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数的影响

分别取乙醇浓度为40%、50%、60%、70%和80%，并固定液料比为1∶30，浸泡时间60 min，超

声波时间30 min的条件下对杜仲叶中绿原酸的提取率进行研究，结果见表1。

表1 乙醇体积分数对杜仲叶中绿原酸的提取率的影响表

乙醇浓度低时，杜仲叶难以溶解，绿原酸得率低；浓度增高后，杜仲叶溶解，绿原酸得率增大。但杜仲叶中包括绿原酸在内的成分随乙醇浓度的增大不断被提取，当杜仲叶中绿原酸完全提取后，其他杂质也被大量提取，导致绿原酸得率下降。由表1可知，绿原酸奶得率随乙醇浓度增大先增高后降低，故取乙醇浓度为50%较佳。

2.1.2 料液比的影响

分别取料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35，并固定乙醇浓度为最优选50%，浸泡时间60 min，超声波时间30 min的条件下对杜仲叶中绿原酸的提取率进行研究，结果见表2。

表2 料液比对杜仲叶中绿原酸的提取率的影响表

由表2可知，绿原酸得率随料液比的增大先快速升高后缓慢升高。杜仲叶中绿原酸随料液比增大不断析出，料液比过小，杜仲叶难以溶解，且绿原酸提出后溶液成为绿原酸饱和溶液，导致杜仲叶中绿原酸无法继续提出；料液比增大绿原酸得率明显增大，之后料液比再增大时，由于绿原酸已经基本完全提出，得率增大不明显。从节约试剂的角度看料液比过大不经济。故当料液比为1∶30时较佳。

2.1.3 超声波时间的影响

分别取超声波时间为0、10、20、30 min和40 min，并固定乙醇浓度为最优选50%，料液比为最优选1∶30，浸泡时间60 min的条件下对杜仲叶中绿原酸的提取率进行研究，结果见表3。

表3 超声波时间对杜仲叶中绿原酸的提取率的影响表

通过超声波可以快速有效的提取杜仲叶中的绿原酸，但也可以提出其他杂质，超声波时间增加，杂质增多，此外，长时间超声波使溶液受热也会导致绿原酸分解，绿原酸得率下降。由表3可知，绿原酸得率随超声波时间的增长先升高后降低，所以超声波时间为20 min较佳。

2.1.4 浸泡时间的影响

分别取浸泡时间为0、30、60、90 min和120 min，并固定乙醇浓度为最优选50%，料液比为最优选1∶30，超声波时间为最优选20 min的条件下对杜仲叶中绿原酸的提取率进行研究，结果见表4。

表4 浸泡时间对杜仲叶中绿原酸的提取率的影响表

不浸泡，杜仲叶和溶剂乙醇接触时间过短，不能将绿原酸全部提出。通过浸泡杜仲叶粉末绿原酸不断提出，绿原酸得率增大，但随着浸泡时间的延长，杂质变多、绿原酸分解变质，不利于绿原酸提取，反而会导致绿原酸得率大幅下降。由表4可知，绿原酸得率随浸泡时间的增长先升高后降低，所以浸泡时间为30 min较佳。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取影响绿原酸提取的因素，乙醇浓度、料液比、超声波时间、浸泡时间，设计4因素3水平的L9-3-4正交试验，以进一步优化提取条件，正交试验的因素水平设计见表5。

表5 正交试验因素水平表

2.2.2 正交试验结果及极差分析

按表5进行正交试验，正交试验结果及极差分析见表6。

表6 正交试验结果及极差分析表

由表6可知，影响绿原酸提取的主次因素为乙醇浓度＞超声波时间＞料液比＞浸泡时间。最佳组合是A1B3C3D3，即杜仲叶中绿原酸的最佳提取工艺为乙醇浓度40%，料液比1∶35，超声波时间30 min，浸泡时间60 min，此条件下绿原酸的得率为8.041 8 mg/g。

3 结论

采用单因素和正交试验来确定提取绿原酸的最佳工艺条件，得到以下结果：乙醇浓度40%，料液比1∶35，超声波时间30 min，浸泡时间60 min，选取即组合A1B3C3D3时绿原酸得率最大，为8.041 8 mg/g。

实验表明杜仲叶中富含的绿原酸，是提取绿原酸的重要来源。本实验为绿原酸的提取纯化工艺的进一步研究提供了参考数据，可为生产生活及绿原酸今后衍生产品的开发和应用提供理论依据。

［1］袁天翊，方莲花，吕 扬，等.杜仲叶的药理作用研究进展［J］.中国中药杂志，2013（6）：781-785.

［2］王 茜，李 智，何 琦，等.杜仲叶中绿原酸提取分离工艺条件的研究［J］.离子交换与吸附，2008（1）：73-80.

［3］向灿辉，罗 景，王文君，等.杜仲叶绿原酸抗氧化稳定性研究［J］.食品科技，2013（1）：224-227.

［4］袁 华，邓 良，杨小俊，等.杜仲叶中绿原酸的提取纯化研究［J］时珍国医国药，2007（2）：446-448.

The Extraction Process of Chlorogenic Acid in Eucommiaulmoides Leaves by Orthogonal Design

Zhang Lei， Zhang Na， Zhan Wenlin
（College of Chemistry and Environmental Science， Shaanxi Sci-Tech University，Hanzhong 723000， China）

To optimize the extraction process of chlorogenic acid in Eucommia leaf （ECA）， choosing ethanol concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time and soaking time as influencing factors. The extraction process of chlorogenic acid was studied by single factor test and then the parameters were optimized by orthogonal test. As the result，the optimum extraction conditions is Ethanol concentration 40%，solid-liquid ratio 1∶35， ultrasonic time 30 min， soaking time 60 min， the yield of chlorogenic acid under this condition was 8.041 8 mg/g. ECA rich in chlorogenic acid and optimize the extraction process of chlorogenic acid in ECA， which can provide a theoretical basis for the development and application of chlorogenic acid.

Eucommia leaf （ECA）； Chlorogenic acid； Extract； Process

TQ464

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.14.037

张蕾（1995- ），女，陕西西安人，本科在读；主要研究方向为化学工程与工艺。