血管生长素的差异表达对鉴别前列腺癌雄激素依赖性和非依赖性的临床意义的研究

田河 南锡浩 于峰 白吉祥 邸彦橙 郭振海 吴影

【摘要】目的：研究雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌中血管生长素（ANG）的差异性表达的临床意义，以了解雄激素非依赖性前列腺癌的发病机制。方法：研究时间为2013年7月至2015年7月，采用体外培养的方式分别培养雄激素依赖性（LNCaP细胞）和非依赖性（PC-3细胞）前列腺癌细胞株，并与正常健康人群进行对比；分别在细胞和组织水平上对ANG水平和表达情况进行分析归纳。结果：前列腺癌患者ANG阳性表达率显著高于正常健康人群（P<0.05）；雄激素依赖性前列腺癌患者各分期中ANG水平明显低于非依赖性患者，P<0.05，统计学具有显著差异意义。结论：ANG在雄激素依赖性前列腺癌向非依赖性前列腺癌转化中具有主导作用，ANG可能成为肿瘤的标记物。

【关键词】雄激素依赖性前列腺癌；雄激素非依赖性前列腺癌；血管生长素；差异表达

Research of ANG differentially expression in identification of androgen-dependent and independent prostate cancerTIAN He， NAN Xihao△， YU Feng， BAI Jixiang， DI Yancheng， GUO Zhenhai， WU Ying. Department of Urology， Mudanjiang Medical College Hongqi Hospital， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China

【Abstract】Objectives： To study the clinical significance of differential expression of ANG in androgen-dependent and independent prostate cancer in order to understand the pathogenesis of androgen-independent prostate cancer. Methods： From July 2013 to July 2015， by way of in vitro culture， we got androgen-dependent （LNCaP cells） and independent （PC-3 cells） prostate cancer cell lines. The cell sample from healthy people was used as control sample； ANG and expression levels at the cellular and tissue levels were respectively analyzed and summarized. Results： ANG expression in prostate cancer patients were significantly higher than that in normal healthy population （P<0.05）. In various stages， ANG levels of androgen-dependent prostate cancer were significantly lower than that of non-dependent prostate cancer， with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion： ANG has a leading role in the conversion to non-independent prostate cancer in androgen dependent prostate cancer and ANG may become tumor marker.

【Key words】Androgen dependent prostate cancer； Androgen-independent prostate cancer； ANG； Differential expression

【中图分类号】R737.25【文献标志码】A

前列腺癌是西方国家老年男性最常见的恶性肿瘤，在我国发病呈逐年增多的趋势。尽管去势治疗对于进展期前列腺癌患者是最有效的治疗方法，但癌细胞会逐渐发展为雄激素非依赖性，在内分泌治疗后一旦演变为激素非依赖性前列腺癌，则对患者的治疗和预后带来极大的困难。前列腺癌细胞获得激素非依赖性的机制，可能与多种因素有关，虽已成为目前国内外的研究热点但仍处于探索阶段。近来研究显示[1，2]，血管生长素（angiogenin， ANG）在前列腺癌的发生和发展中扮演重要角色。已有报道前列腺癌患者血清ANG水平高于正常人水平，并且在前列腺癌组织中高表达[3]。国内有研究表明ANG在前列腺癌组织中表达显著高于前列腺良性增生组织，ANG的表达随前列腺癌患者临床分期的升高而上调[4]。本研究价值在于证实ANG是否在雄激素依赖性前列腺癌向雄激素非依赖性前列腺癌演变过程中发挥着主导作用，从而揭示雄激素依赖性前列腺癌向雄激素非依赖性前列腺癌的演变机制。研究前列腺癌患者血清ANG水平和前列腺癌进展程度的关系，其前景是为ANG能成为肿瘤的标记物提供基础。现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

研究时间为2012年7月至2015年7月，病例纳入标准[5]：临床表现为尿无力、尿流缓慢、尿线变细、尿不尽、尿流中断、尿急、尿频、急性尿潴留、夜尿增多；均经病理活检证实为前列腺癌或前列腺增生；1个月内无前列腺损伤性检查（前列腺电切术、前列腺穿刺活检、直肠内超声检查等）。排除标准：其他恶性肿瘤病史；磁共振检查禁忌症；不愿配合研究者。入选的研究对象为雄激素依赖性前列腺癌患者32例作为A组，雄激素非依赖性前列腺癌32例作为B组，另选取同期健康人群32例作为对照组。A组患者年龄在46～62岁，平均（58.6±6.2）岁；病程1～5年，平均（3.5±0.4）年；B组患者年龄在45～65岁，平均（57.9±5.6）岁；病程1～5年，平均（3.2±0.5）年；对照组年龄在40～70岁，平均（59.6±7.3）岁。三组研究对象年龄的比较上无明显差异，存在可比性。

1.2细胞株和试剂

雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP细胞、雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3细胞均由中科院细胞库提供。LNCaP细胞在F12培养基（10%胎牛血清）中进行增殖培养传代，PC-3细胞在RPMI 1640培养基（10%胎牛血清）中进行增殖培养传代。培养时温度均为37℃，二氧化碳5%。

1.3方法

ANG在正常前列腺细胞和前列腺癌细胞系的表达：（1）人前列腺细胞系PC-3M和前列腺癌细胞系LNCaP购自中科院细胞库，按相关文献报道培养，LNCaP在激素递减环境下经连续传代形成激素非依赖的LNCaP-AI细胞系；（2）提取各组细胞总RNA，real-time PCR检测各组ANG mRNA含量；（3）提取细胞总蛋白，western-blot检测各组ANG蛋白含量。RNA干扰ANG合成后观察细胞生物学变化：（1）设计ANG靶向siRNA，以脂质体为载体转染LNCaP和LNCaP-AI细胞系，同时设计空白载体组；（2）稳定转染后，观察各组细胞形态变化；（3）用CCK-8法、自动酶标仪测定每孔的光密度（D）值比较转染前后各组细胞生长曲线变化；（4）以标准方法采用流式细胞仪检测转染前后各组细胞周期；（5）用Transwell小室和0.25% 考马斯亮蓝染色、正置显微镜进行计数观察转染前后各组细胞侵袭力。

1.4统计学分析检验方法

实验数据录入SPSS14.0专业统计学软件完成分析检验，计量时数据录入形式为（±s），完成t检验，计数时数据录入形式为%，完成χ2检验，当P<0.05时，统计学差异具有显著意义。

2结果

2.1ANG表达结果分析

与对照组相比，A组和B组患者ANG蛋白（+）信号表现为棕黄色颗粒，位于胞浆部位。64例前列腺癌患者中ANG蛋白呈（+）56例，占87.50%，与对照组的0.00%比较，χ2=156.36，P<0.05，统计学差异显著；强度主要集中在中等或强阳性。癌旁组织中ANG蛋白主要存在于血管平滑肌细胞、内皮细胞、少量的炎性细胞等，均呈弱阳性。

2.2ANG检测阳性表达比较

A组和B组患者ANG均为不同程度的阳性表达，但不同分期中A组阳性表达低于B组，P<0.05，统计学差异显著。见表1。

3讨论

前列腺癌患者血清ANG水平高于正常人水平，并且在前列腺癌组织中高表达ANG[6]。本研究中，A组与B组患者ANG阳性表达率明显高于对照组（P<0.05），提示前列腺癌患者ANG阳性表达出现异常。国内有研究表明ANG在前列腺癌组织中表达显著高于前列腺良性增生组织，ANG的表达随前列腺癌患者临床分期的升高而上调。由于多种因素诱发前列腺组织内的ANG异常合成增加进而促进腺体内血管增生、内皮细胞迁移粘附很可能是推进前列腺癌进展的关键因素之一[7，8]。我们推测，在雄激素促进前列腺癌发生发展的同时，ANG很可能也发挥着作用。尤其是进行去势治疗后，体内雄激素水平下降，在癌细胞逐渐发展为雄激素非依赖性的过程中，ANG的表达可能会明显增加成为主要的促肿瘤因素，最终使激素依赖性前列腺癌（ADPC）演变为激素非依赖性前列腺癌（AIPC）。

研究结果中：A组（雄激素依赖性前列腺癌）患者ANG蛋白水平在A、B、C、D四个分期的表达中均低于B组（雄激素非依赖性前列腺癌），统计学差异显著（P<0.05）；雄激素依赖性前列腺癌向非依赖性发展时，ANG水平明显发生变化，提示ANG在病情的发生发展中具有一定作用。ANG是1985年Fett等首次从培养的人结肠腺癌细胞株HT-29的无血清上清液中分离到的，ANG具有核糖核酸酶的活性，这是是其促血管生成功能所必需的[9]。ANG蛋白含123个氨基酸，相对分子量为14.4kD，虽然在肿瘤细胞中首先发现，但也存在于人体正常细胞中，可由多种组织和细胞分泌，在生理状态下其表达受到严格的调控。ANG是一种非常有效的促血管生成因子，可对血管的内皮细胞及平滑肌细胞产生很强的促增殖作用。目前ANG在很多缺血性疾病（胎盘缺血、心肌缺血等）的诊断与治疗中体现出一定价值[10]。ANG与肿瘤关系密切。肿瘤性血管内皮细胞膜上存在ANG 高度特异性的整合素作为 ANG 受体介导内皮细胞的增殖粘附和迁移，并且ANG结合于肿瘤细胞及内皮细胞的表面或细胞外基质，起到连接两种细胞的作用。在多种恶性肿瘤患者中ANG在肿瘤组织中的表达和血清ANG水平均明显升高，ANG且与肿瘤进展有关，提示预后较差或复发，如胰腺癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、胃癌、肝细胞癌、浸润性宫颈癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和急性髓性白血病等[11]。癌变的发生、发展、浸润以及转移等对血管新生有显著的依赖性。癌细胞分泌的各类因子对血管内皮细胞产生作用，促进其增殖，在宿主内生成新的血管网，为瘤体的生长提供营养。ANG家族在其受体Tie-2的作用下对新生成的血管产生作用，并维持其稳定性。ANG-1因子具有内皮细胞趋化作用，同时能够增加其生存时间。ANG-2与ANG-1具有拮抗作用，均受其Tie-2受体的调控与其具有一致的亲和力。但临床对ANG参与血管的新生机制尚未明确。大部分学者研究认为：ANG-1结合受体后促进磷酸化的发生，借助细胞和基质间的作用对血管结构进行调控，稳定血管结构；而ANG-2与ANG-1发生竞争抑制性作用，阻断血管内皮细胞与外周细胞的作用，对血管的重塑产生抑制，导致血管结构不稳定，松解血管增强VEGF的促血管新生作用，生成新的毛细血管[12，13]。林楠等学者对动物进行实验发现[14]：肝移植瘤中肿瘤的形成时ANG-2表达过度，说明ANG与肿瘤新生血管的生长具有相关性，可促进其生长；本文研究与其结果相近，说明ANG在前列腺癌病情发展的机制中具有重要作用。

综上，由于多种因素诱发前列腺组织内的ANG异常合成增加进而促进腺体内血管增生、内皮细胞迁移粘附很可能是推进前列腺癌进展的关键因素之一[15]。我们推测，在雄激素促进前列腺癌发生发展的同时，ANG很可能也发挥着作用。尤其是进行去势治疗后，体内雄激素水平下降，在癌细胞逐渐发展为雄激素非依赖性的过程中，ANG的表达可能会明显增加成为主要的促肿瘤因素，最终使激素依赖性前列腺癌演变为激素非依赖性前列腺癌。研究在该演变过程中前列腺癌细胞内ANG的表达变化对了解激素非依赖性前列腺癌的形成机制有重要意义。

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