超高效液相色谱-串联质谱法测定海水悬浮颗粒物中的8种典型脂溶性藻毒素

王艳龙陈军辉*，高莉媛王　帅，郑晓玲孙承君王小如(国家海洋局第一海洋研究所，海洋生态研究中心，青岛6606)(青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋生态与环境科学功能实验室，青岛6607)

研究报告

超高效液相色谱-串联质谱法测定海水悬浮颗粒物中的8种典型脂溶性藻毒素

王艳龙1陈军辉*1，2高莉媛1王帅1，2郑晓玲1孙承君1王小如1
1(国家海洋局第一海洋研究所，海洋生态研究中心，青岛266061)2(青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋生态与环境科学功能实验室，青岛266071)

海水悬浮颗粒物对海洋环境中污染物的迁移转化有着重要的影响，在海水悬浮颗粒物上富集的脂溶性藻毒素会严重的毒害海洋滤食性生物。本研究建立了海水悬浮颗粒物中8种典型脂溶性藻毒素同步测定的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法。海水悬浮颗粒物样品经甲醇超声辅助提取后，以5 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈为流动相，经1．7微米C18色谱柱分离，采用电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)多反应监测(MRM)模式检测，外标法定量。结果表明，在最佳实验条件下，8种目标物在5min内分离良好，加标回收率在83．8%～110．4%之间，方法具有良好的精密度(相对标准偏差(RSD)≤14．1%)和灵敏度(检出限介于2．9～103 pg/g之间)，在线性范围内，相关系数(R2)均大于0．996，能满足海水悬浮颗粒物中8种典型脂溶性藻毒素同步检测的要求。采用本方法初步分析了青岛沿岸海域海水悬浮颗粒物中的脂溶性藻毒素，其中PTX2被检出，含量最高可达790 pg/g(干重)。

超高效液相色谱-串联质谱;脂溶性藻毒素;海水;悬浮颗粒物;扇贝毒素

1　引言

海洋藻类产生的生物毒素是目前已知的最毒的一类天然有机化合物之一，迄今为止，已发现的海洋藻类生物毒素及其衍生物约有200多种［1］，按溶解性质可分为水溶性毒素和脂溶性毒素，其中脂溶性毒素约占90%，由于脂溶性毒素种类繁多，在全球范围内分布广泛，对海洋生态环境、海产养殖业及海产品安全影响巨大。近年来，随着人们对海产品中脂溶性藻毒素的高度关注，对海洋环境中脂溶性藻毒素的研究也越来越深入，多名学者分别从美国、智利、澳大利亚、爱尔兰、中国等海域海水中发现多种脂溶性毒素(主要包括大田软海绵酸(OA)、鳍藻毒素(DTX)、扇贝毒素(PTX)、虾夷扇贝毒素(YTX)、原多甲藻酸(AZA)、罗环内酯毒素(SPX)等系列脂溶性藻毒素)［2～10］，而关于海水悬浮颗粒物中脂溶性藻毒素的研究却鲜有报道，也没有针对海水悬浮颗粒物中脂溶性藻毒素的有效检测方法。

海水中悬浮颗粒物是海洋水体的重要组成部分，对水体中的污染物有很强的吸附能力，从而影响水体中污染物的迁移转化和循环归宿［11，12］。脂溶性污染物由于其疏水性强、在水中的溶解度低，使得它们易于在悬浮颗粒物上富集［13］。文献［14］指出，海水中颗粒有机物是滤食性贝类的主要饵料之一，直接影响到滤食性贝类的摄食行为和生理活动;文献［15］指出，悬浮颗粒物上富集的污染物更容易被水生生物体利用。因此，建立用于海水悬浮颗粒物中多种典型脂溶性藻毒素的检测方法，对阐明海洋水体中脂溶性藻毒素在悬浮颗粒物中的赋存状态，揭示脂溶性藻毒素的环境行为具有重要意义。

高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)由于具有灵敏度高、选择性好、可提供待测物的结构信息，以及在一个分析中可以同时测量多种化合物等优点，目前已成为海产品［16～18］、海洋微藻［19～22］及海水［23］中多种脂溶性藻毒素测定的常用方法。本课题组在前期研究中采用HPLC-MS/MS实现了海水中3种脂溶性藻毒素的检测，在此基础上，本研究采用超高效液相色谱-串联质谱技术(UPLC-MS/MS)，通过对样品前处理实验方法及UPLC-MS/MS分析条件的优化，建立适用于海水悬浮颗粒物中8种典型脂溶性藻毒素(OA、米氏裸甲藻毒素(GYM)，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2)同步检测的新方法，并用于青岛近岸海域海水悬浮颗粒中脂溶性藻毒素的检测。

2　实验部分

2．1仪器与试剂

Acquity UPLC超高效液相色谱系统(美国Waters公司)，Thermo TSQ Endura三重四级杆质谱仪，配有电喷雾(ESI)离子源(美国Thermo Fisher公司);KQ-400KDE型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);R201型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);BSA224S-CW型电子天平(德国Sartorius公司);Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司);乙酸铵(优级纯，瑞士Fluka公司);水为自制Milli-Q超纯水(18．2 MΩ);OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2毒素标准品(加拿大国家海洋研究中心)。

2．2标准溶液制备

取8种脂溶性海洋藻毒素(OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2)标准品各0．5 mL，分别用甲醇稀释并定容至5 mL，得到8种典型脂溶性海洋藻毒素标准储备液(单标)。按照一定的比例分别吸取相应的毒素的单标储备液，用甲醇稀释并定容至10 mL，得8种典型毒素的混合标准储备液，其中OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2浓度分别为6．843，5．003，25．77，56．42，26．30，123．7，25．66和3．436μg/L，混合标准溶液置于-20℃条件下保存备用。

2．3样品采集及前处理

2015年7月23日在青岛沿岸海域选取了4个具有代表性的采样站点(见图1)，分别为中苑码头、第三海水浴场、麦岛和石老人海水浴场，现场取表层海水1．5 L，保存于棕色玻璃瓶中，运回实验室后，使用烘干至恒重的玻璃纤维滤膜(直径为47 mm，孔径为0．45μm)进行过滤，收集固体悬浮颗粒物;将滤膜置于40℃烘箱中烘至恒重，通过十万分之一的电子天平称量和计算，得到悬浮颗粒物的质量。随后，将带有悬浮颗粒物的滤膜放入100 mL烧杯中，并加入10 mL甲醇，保证滤膜全部浸入甲醇溶液中。将烧杯放入超声波仪中进行超声辅助提取，超声波仪参数设置为:温度为室温(20±2℃)、超声时间为30 min、超声功率为100%。超声辅助提取后将提取液移至旋蒸瓶中，在42℃条件下蒸干，然后加入1 mL甲醇进行复溶(涡旋振荡1min);甲醇复溶液经0．22μm滤膜过滤，转移至进样瓶中，在-20℃条件下避光保存，待测。

2．4色谱-质谱条件

2．4．1色谱条件Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2．1 mm，1．7"m，美国Waters公司);流动相:A为5mmol/L乙酸铵溶液，B为纯乙腈;二元淋洗梯度: 0～4min，10%～70%B;4～6min，70%～90%B;6～7 min，90%～10%B;7～10min，10%B。流速:0．3 mL/ min;进样体积:5μL;柱温:室温(20±2℃)。

2．4．2质谱条件电喷雾电离源;GYM，SPX1，AZA1，AZA2和PTX2采用正离子模式(ESI+)检测，OA，DTX1，YTX采用负离子模式(ESI-)检测;电喷雾电压:3500 V;毛细管温度:350℃;辅助气: 5 arb;鞘气:35 arb;干燥气温度:350℃;扫描宽度(m/z):0．01;扫描时间:0．5 s。根据各组分的色谱保留时间和一级、二级质谱特征优化参数，按时间分段以多反应离子监测(MRM)模式对各组分进行质谱检测。8种典型脂溶性藻毒素的保留时间、MRM选择的母离子以及各化合物定性定量子离子、碰撞能量等参数见表1。

表1　8种脂溶性藻毒素串联质谱分析参数Table 1　Parameters of MS/MS in MRM mode for eight lipophilic algae toxins

3　结果与讨论

3．1色谱-质谱条件优化

在采用LC-MS/MS分析环境样品的过程中，色谱对复杂基质中目标化合物的充分分离对提高MS/MS检测灵敏度和降低信号抑制起到了重要作用。乙腈-水是脂溶性海洋藻毒素LC分离时常用流动相［24，25］，而LC分离酸碱性物质时，由于吸附作用(次级保留)会造成色谱峰拖尾，加入改良剂乙酸铵可以减少次级保留，大大改善峰形;因此，以含有5 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈作为流动相，通过优化梯度洗脱程序，在5 min内实现了8种脂溶性海洋藻毒素的分离，各组分保留时间见表1;添加脂溶性藻毒素标准品的空白悬浮颗粒物样品中8种脂溶性藻毒素分离色谱图见图2，可以看出，在优化的条件下，各化合物分离良好。本课题组在前期研究中采用普通HPLC C18柱分离海水中的3种脂溶性海洋藻毒素，完成一个样品的分析时间为50 min［23］，而本实验采用UPLC分离8种脂溶性海洋藻毒素的时间仅为5 min，分离效率提升了10倍。

图2 加标悬浮颗粒物样品UPLC-MS/MS分析MRM色谱图Fig．2　MRM chromatograms of the suspended particles spiked with eight lipophilic algae toxin standards for UPLC-MS/MSanalysis

质谱条件的优化是通过在流动注射模式下，以 10μL/min的流速分别将 OA，GYM，DTX1，SPX1，YTX，AZA1，AZA2和PTX2的标准溶液注入串联质谱的离子源中进行优化。分别在ESI+和ESI-模式下对各目标化合物进行一级质谱全扫描分析，为了使8种目标组分均获得较高的灵敏度，综合考虑，最后确定GYM，SPX1，AZA1，AZA2和PTX2在ESI+模式下进行检测，GYM，SPX1，AZA1，SPX1和AZA2的二级质谱分析母离子均为［M+H］+，而PTX2选择信号最强的［M+NH4］+作为母离子;OA，DTX1，YTX在ESI-模式下进行检测，OA和DTX1二级质谱分析的母离子为［M－H］-，YTX选择信号最强的［M－2H］2-作为母离子。此外，在MS/MS+MS模式下进行子离子扫描，从中选取丰度最强的碎片离子作为各自的定量离子，以次强的碎片离子作为定性离子，并优化碰撞能量，优化的质谱参数见表1。

3．2前处理方法优化

超声波辅助提取具有快速、廉价、高效的优势，已被广泛用于环境介质中有机物的萃取［26］，因而本研究采用超声波辅助提取法提取海水悬浮颗粒物中脂溶性藻毒素。在样品提取过程中，选择合适的提取溶剂既能促进目标化合物的提取，又能消除一些不必要的基质干扰。综合考虑8种脂溶性藻毒素的化学性质，分别以甲醇、异丙醇和丙酮为提取剂，对添加8种脂溶性藻毒素标准品的悬浮颗粒物进行提取，结果见图3，甲醇对毒素OA，DTX1，YTX，AZA1和AZA2的提取率明显高于丙酮和异丙醇，然而对毒素GYM和PTX2的提取率却低于异丙醇，这可能与悬浮颗粒介质的组成(如其中粘土矿物的种类和含量等)有关，具体原因尚需进一步研究。考虑到8种脂溶性藻毒素的总体提取效果，最后选择甲醇作为提取剂。

图3　使用不同提取剂时8种脂溶性藻毒素的提取率Fig．3　Extraction ratio of eight lipophilic algae toxins using different extraction solvents

通过滤膜过滤海水获得悬浮颗粒物之后，需要对悬浮颗粒物进行干燥处理，采用合适的干燥方法将有利于降低目标化合物的损失，本研究将8种脂溶性藻毒素标准品加入悬浮颗粒样品中，分别采用40℃热烘干法和冷冻干燥法进行处理。测量结果(图4)表明，8种脂溶性藻毒素采用两种干燥方法得到的提取率基本相似，并且均具有较好的提取率(各化合物提取率均高于75．0%)，说明8种脂溶性藻毒素在40℃热烘干和冷冻干燥处理过程中均保持着良好的稳定性。考虑到热烘干法相对更便捷，最终选择烘干法处理悬浮颗粒物样品。

图4　不同干燥条件下8种脂溶性藻毒素的提取率Fig．4　Extraction ratio of eight lipophilic algae toxins using different dryingmethods

3．3方法学考察

3．3．1基质效应众所周知，采用ESI作为离子源检测环境样品时，基质效应(离子抑制或离子增强)可以导致测试目标化合物浓度过低或过高，因此，基质效应对目标化合物的分析是一个重要的影响因素。为了评价粗提液中基质对目标化合物质谱分析的影响，采用空白悬浮颗粒物样品的粗提液配制8种脂溶性藻毒素混合标准溶液，以甲醇配制的同一浓度水平的混合标准溶液作为对比，通过MS/MS分析测得各目标化合物的峰面积。基质效应(ME)按式(1)计算:

式中，Ax为空白提取液配制毒素混标中目标化合物的峰面积;As表示相同浓度水平标准样品中毒素的峰面积。实验结果表明(表2)，悬浮颗粒物提取液中的基质组分对各目标化合物有不同程度的抑制作用，抑制率在-12．9%～8．7%范围内。

3．3．2方法的线性范围和检出限由于存在基质效应，标准品在甲醇溶液中的质谱响应与其在实际样品基质中的响应不同，所以本研究采用基质标准曲线外标法对目标化合物进行定量分析，以降低基质效应对测定结果准确度的影响。取配制的8种毒素混合标准溶液使用空白悬浮颗粒物提取液对其进行梯度稀释，稀释倍数分别为1，2，5，10，20，50和100，按2．4节的分析条件进行测定。以被测组分的峰面积y为纵坐标，所测毒素的质量浓度x为横坐标，绘制定量标准曲线。将信噪比为3对应的质量浓度作为方法的检出限(LOD)，信噪比为10对应的质量浓度作为方法的定量限(LOQ)。在MRM模式下选择定量离子计算目标化合物EIC峰面积，代入线性曲线计算样品浓度，以实现对实际样品中的毒素定量，试样溶液中待测物的响应值均应在本方法线性范围内。8种脂溶性藻毒素LC-MS/MS分析的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、和定量限见表2。

表2　线性范围、灵敏度和基质效应实验结果Table 2　Results of linear range，sensitivity and matrix effects

3．3．3回收率和精密度为了考察方法的准确性和可靠性，取8种毒素的混合标准品溶液采用标准加入法，将30，100和200μL的8种毒素标准品混合溶液分别加入悬浮颗粒样品中，每个添加水平重复6次，按照2．3和2．4节所述步骤进行样品处理和测定，各化合物回收率和相对标准偏差(RSD)测定结果如表3所示。悬浮颗粒物中添加的8种脂溶性藻毒素的回收率为83．8%～110．4%，相对标准偏差(RSD)均低于14．1%，表明本方法的回收率和精密度良好，能满足实际悬浮颗粒物样品中各种脂溶性藻毒素的准确测量的要求。

表3　加标回收率和精密度实验结果Table 3　Results of recovery and precision

3．4青岛近岸海水悬浮颗粒物中毒素的测定

采用已建立的UPLC-MS/MS方法，对青岛近岸海域4个站点海水中的悬浮颗粒物样品进行了8种典型脂溶性藻毒素的检测。通过比较悬浮颗粒物样品与毒素标准溶液的提取离子色谱(EIC)峰的保留时间及二级质谱图的特征定性离子和定量离子对目标化合物进行定性，定量检测结果表明，中苑码头和麦岛的海水悬浮颗粒物样品中8种脂溶性毒素的含量均低于本方法的检出限，而石老人和第三海水浴场的海水悬浮颗粒物样品中检测出了毒素PTX2，其含量分别为717和790 pg/g。

4　结论

本研究建立了适用于海水悬浮颗粒物中脂溶性藻毒素测定的超高效液相色谱串联质谱检测方法。本方法简单快捷、灵敏度和精密度高，回收率良好，能够满足海水悬浮颗粒物样品中8种典型脂溶性藻毒素同时测定的要求。此外，对采自青岛近岸海域4个站点海水悬浮颗粒物样品进行了检测，在两个样品中检测出了毒素PTX2，说明青岛近岸海水悬浮颗粒物中存在一定程度的脂溶性毒素污染。

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Determination of Eight Typical Lipophilic Algae Toxins in Particles Suspended in Seawater by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Yan-Long1，CHEN Jun-Hui*1，2，GAO Li-Yuan1，WANG Shuai1，2，ZHENG Xiao-Ling1，SUN Cheng-Jun1，WANG Xiao-Ru1
1(Research Center for Marine Ecology，The First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China)2(Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266071，China)

The particles suspended in seawater have great influence on pollutantmigration and transformation in marine environment，while the lipophilic algae toxins enriched by the particles suspended in seawater will lead more serious toxicity to marine filter feeders．In this study，a new method was developed for the simultaneous determination of eight lipophilic algae toxins in suspended particles by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)．After extracted with methanol by ultrasonicassisted extraction，the sample was separated on an Acquity UPLC BEH C18 column(50 mm×2．1 mm，1．7μm)using gradient elution of acetonitrile and water containing 5 mmol/L ammonium acetate as eluent modifiers．The qualitative and quantitative analyseswere carried out by electrospray ionization(ESI)tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring(MRM)mode．Under the optimal conditions，satisfactory precision(relative standard deviations(RSD≤14．1%)，recoveries(83．8%－110．4%)and detection limits (2．9－103 pg/g)of themethod were achieved．Good linearity(R2≥0．99)was also obtained for all studied analytes．Then，the method was applied to determine the amounts of the eight lipophilic marine toxins in authentic suspended particle samples collected from Qingdao near-shore area．Pectenotoxin 2(PTX2)was detected in the samples from Shilaoren beach and No．3 bathing beach with concentration ranges of 717 and 790 pg/g，respectively．

Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Lipophilic algae toxins; Seawater;Suspended particles;Pectenotoxin 2

9 September 2015;accepted 20 December 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150714

2015-09-09收稿;2015-12-20接受

本文系国家基金委-山东省联合基金项目(No．U1406403)、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(No．2014T05)、山东省自然科学基金(No．ZR2015PD003)和2012泰山学者海外人才项目资助

*E-mail:jhchen@fio．org．cn