基于壳聚糖/Ru(bpy)23+/SiO2纳米粒子电化学发光传感器用于尿酸的检测

樊雪梅　王书民　李哲建　郑行望(商洛学院化学工程与现代材料学院，商洛76000)　(陕西师范大学化学化工学院，西安7006)

基于壳聚糖/Ru(bpy)23+/SiO2纳米粒子电化学发光传感器用于尿酸的检测

樊雪梅*1王书民1李哲建1郑行望21
1(商洛学院化学工程与现代材料学院，商洛726000)2(陕西师范大学化学化工学院，西安710062)

利用反相微乳液法制备了壳聚糖复合纳米粒子，采用Nafion/MCNT复合膜技术实现了对复合纳米粒子有效而稳定的固定，从而制备了电化学发光传感器，实现了对尿酸的检测。在0．1 mol/L PBS缓冲溶液(pH 7．4)中，当尿酸与修电极作用15 min时，电化学发光强度与尿酸浓度(1．0×10-10～1．0× 10-5mol/L)的负对数呈良好的线性关系，线性方程为IECL=-709．52－202．74lg C，相关系数R=0．9936，检出限为6．0×10-12mol/L。传感器表现出良好的重现性与稳定性，对1．0×10-8mol/L尿酸平行测定11次，发光强度的相对标准偏差为2．9%，测定尿酸实际样品的加标回收率在98．5%～103．5%之间。

电化学发光;壳聚糖纳米粒子;尿酸

1　引言

尿酸是核蛋白和核酸的代谢产物，人体内尿酸过量是许多疾病的征兆，如痛风、肾功能衰竭、心血管疾病等，故人体内尿酸的检测在临床诊断方面有着重要意义。目前，测定尿酸的方法主要有色谱法［1，2］、分光光度法［3，4］、荧光法［5，6］、化学发光法［7，8］、电化学法［9～11］等。

电化学发光因其设备简单、灵敏度高、适用范围广等特点而备受关注。但是目前利用电化学发光法测定尿酸的方法较少［12，13］。近年来，通过将发光试剂固定在电极表面制备得到固相电化学发光传感器，这样既节约了昂贵的发光试剂，又提高了灵敏度，拓宽了电化学发光法在分析化学中的应用。溶胶-凝胶膜法和Nafion/MCNT是目前应用最多的固定化技术，但是溶胶-凝胶法制备的电化学发光传感器稳定性较差［14］。利用二氧化硅微球包埋联吡啶钌，可以改善SiO2溶胶-凝胶法固定联吡啶钌传感器的稳定性［15，16］。壳聚糖分子中含有丰富的游离氨基和羟基，具有良好的吸附能力、导电能力和生物相容性，是电化学发光传感器中较优良的材料［17］。

2　实验部分

2．1仪器与试剂

MPI-E型电致化学发光分析系统(西安瑞迈电子科技有限公司)，Zennium电化学工作站(德国Zahner公司)，UV-1600PC紫外-可见分光光度计(中国上海美谱达仪器有限公司)，F-4600荧光分光光度计(日本日立公司)，RT5 POWER电磁搅拌机(德国IKA公司)，WF-300D超声波清洗机(宁波海曙五方超声设备有限公司)，TDL-802B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，PT-RO 10L实验室超纯水设备(上海品拓环保工程设备有限公司)。三电极系统:工作电极为裸玻碳电极或修电极，Pt丝为对电极，Ag/AgCl (饱和KCl溶液)为参比电极。

多壁碳纳米管(MCNT，中国科学院成都有机化学有限公司，＞7．5%，7～15 nm×0．5～10μm．);壳聚糖(MW=60000～120000 g/mol，乙酰化度≤40 mol%)、三联吡啶钌、Nafion 117、正硅酸乙酯、Triton×-100、正己醇、环己烷均购于Sigma公司;尿酸(天津市华东试剂厂);其余试剂均为分析纯。

2．2CRuS NPs的制备

分别取7．5 mL环己烷、1．8 mL TrionX-100和正己醇混合，加入300μL超纯水为分散相，搅拌0．5 h后，依次加入50μL 0．01 moL/L三联吡啶钌和150μL 0．5%壳聚糖溶液形成稳定的油包水结构，并加入适量NaOH溶液，将体系调为中性，然后持续搅拌1 h，依次加入90μL正硅酸乙酯、60μL氨水，再持续搅拌24 h，反应完全后，加入6 mL丙酮破乳，离心收集复合纳米粒子，然后分别以乙醇、超纯水超声离心，吸取上清液得复合纳米粒子，最终将其分散在NaAc-HAc缓冲溶液(pH 5．0)中，2℃保存。

2．3电化学发光传感器的制备

将玻碳电极(直径2 mm)在0．05μmAl2O3抛光粉上打磨光亮，分别在HNO3(1∶1，V/V)，乙醇(1∶1，V/V)，超纯水中超声3 min，干燥后。取10μL Nafion/MCNT混合液滴加于干净的玻碳电极表面，自然晾干。将修好的电极插入200μL均匀的CRuSNPs溶液中30 min，CRuSNPs复合纳米粒子通过静电吸附随时间逐渐自组装于Nafion/MCNT电极表面，随后用0．01 mol/L PBS(pH 7．4)冲洗电极，去除非特异性吸附的CRuSNPs纳米粒子，随后，用循环伏安技术将CRuSNPs/Nafion/MCNT电极在0．9～1．4 V的电位窗口下扫描至稳定，除去电极表面多余的，最终可制得电化学发光传感器。图1为电化学发光传感器的原理图。

图1　电化学发光传感器的原理图Fig．1　Principle diagram ofelectrochemical luminescence sensor

2．4实验方法

以CRu NPs/Nafion/MCNT/GCE修电极为工作电极，当电解池中的尿酸与修电极作用15 min后，在-0．2～1．4 V范围内进行循环伏安扫描，扫描速率为100mV/s，介质为0．10mol/L PBS缓冲溶液(含50 mmol/L TPA，pH 7．4)，光电倍增管负高压为800 V，记录电化学发光信号，通过电化学发光强度值对尿酸进行定量分析，所有实验均在室温下进行，所有电位值均相对于Ag/AgCl参比电极。

3　结果与讨论

3．1CRuSNPs的表征

对合成的CRuSNPs进行了TEM表征(图2)，由图2可知，所制备的纳米颗粒的平均直径为50 nm且分散效果较好。CRuSNPs的紫外和荧光光谱图见图3。由图3A可知，合成的CRuSNPs复合纳米粒子与游离态的紫外吸收光谱形状相同，可知CRuSNPs在水溶液中具有很好的分散性。由图3B可知，在458 nm激发波长下，游离态的最大发射波长为596 nm，而CRuSNPs的最大发射波长较蓝移了17 nm，这可能是因为CRuSNPs溶液中的SiO-基团与之间的静电吸附使得被束缚在SiO2纳米粒子内部，致使CRuSNPs在溶液中时，很少与周围的水分子相互作用，显示出荧光发射波长相对较短［18］。

3．2传感器的电化学及电化学发光行为

实验对不同电极表面进行了电化学及电化学发光行为进行研究。由不同电极在0．1 mol/L PBS (pH 7．4)中循环伏安图(图4A)可见，Nafion/MCNT修电极(曲线 b)的电流强于裸玻碳电极(曲线a)，这是因为MCNT具有较强的导电性，说明Nafion/MCNT已修于玻碳电极上，而CRuSNPs/ Nafion/MCNT修电极(曲线c)的电流强于Nafion/MCNT修电极(曲线b)，这是因为CRuSNPs纳米粒子具有较大的比表面积，电子传导能力增强，且由曲线c还可看出，在+1．1 V处出现可逆的氧化还原峰，这正是的特征峰，说明CRuS NPs已成功修于Nafion/MCNT上。

由不同电极在50 mmol/L TPA(0．1 mol/L PBS，pH 7．4)中的电化学发光图(图4B)可知，裸电极(曲线a)和Nafion/MCNT修电极(曲线b)几乎不发光，但将CRuSNPs纳米粒子固定在Nafion/MCNT修电极上时，出现明显的发光现象(曲线c)，这表明CRuSNPs已很好地固定在Nafion/MCNT电极表面，从而显示出良好的电化学发光行为。

稳定性和重现性对于构建可重复使用的修电极至关重要。由CRuS NPs/Nafion/MCNT修电极连续扫描电化学发光图(图4C)可见，Nafion/MCNT与CRuSNPs混合膜修电极在连续扫描10圈的过程中，电化学发光信号非常稳定。

图2 CRuSNPs的TEM图Fig．2　TEM image of chitosan-Rucomposite nanoparticles(CRuSNPs)

图3 Ru(bpy)和CRuSNPs(b)的紫外光谱图(A)和荧光光谱图(B)Fig．3　UV-vis spectra(A)and fluorescence spectraand CRuS NPs(b)

图4　不同电极在0．1 mol/L PBS(pH 7．4)中的循环伏安曲线(A)，不同电极在0．1 mol/L PBS(含50 mmol/L TPA，pH 7．4)中的电化学发光曲线(B)，CRu NPs-Nafion/MCNT修电极循环电位扫描10圈的电化学发光-时间曲线(C)，其中GCE(a)，Nafion/MCNT/GCE(b)，CRu NPs-Nafion/MCNT/GCE(c)Fig．4　Cyclic voltammograms obtained at different electrodes in 0．1 mol/L PBS(pH=7．4)(A)，ECL intensitypotential profiles obtained at different electrodes in 0．1mol/L PBS(pH 7．4)containing 50mmol/L tri-n-propylamine(TPA)(B)，ECL intensity-time curves of CRu NPs-Nafion/MCNT/GCE obtained in 0．1 mol/L PBS (pH 7．4)containing 50 mmol/L TPA from continuous potential scanning over ten cycles(C)．GCE(a)，Nafion/MCNT/GCE(b)，CRu NPs-Nafion/MCNT/GCE(c)

3．3尿酸在CRuSNPs/Nafion/MCNT修电极上的电化学发光行为

考察了尿酸在CRuS NPs/Nafion/MCNT修电极上的电化学发光行为。如图5所示，当在0．10 mol/L PBS(含50 mmol/L TPA，pH 7．4)中加入1．0×1007mol/L尿酸时，电化学发光强度降低，证明尿酸对 CRuS NPs/Nafion/MCNT修电极上的电化学发光有抑制作用。众所周知，对于电化学发光体系被电氧化为而TPA被电氧化为TprA0+，从而形成TprA0自由基和TprA0+反应得到从激发态返回至基态便产生电化学发光。尿酸对该电化学发光体系的猝灭原因可能是由于尿酸的加入，消耗了部分所致［13］。

图5　CRuS NPs/Nafion/MCNT/GCE在含50 mmol/L TPA的0．10 mol/L pH 7．4 PBS(a)和含50 mmol/L TPA和0．10μmol/L尿酸的0．10 mol/L pH 7．4 PBS (b)中的电化学发光响应图。Fig．5　ECL intensity-potential profiles obtained at CRuS NPs/Nafion/MCNT/GCE　in(a)　0．1　mol/L　PBS (pH 7．4)　containing 50　mmol/L　TPA　and　(b) 0．1 mol/L　PBS　(pH 7．4)　containing　containing 50 mmol/L TPA and 1．0×1007μmol/L uric acid．

3．4实验条件的选择

CRu NPs中的羟基能与尿酸中的胺基形成氢键，故CRu NPs/Nafion/MCNT/GCE修电极与尿酸的作用时间及体系的pH值均对电化学发光强度有一定的影响。由图6可知，随着反应时间延长，电化学发光信号逐渐降低，到15 min时发光强度趋于平稳，再继续延长结合时间，响应信号几乎不变。这表明15 min时即可达到猝灭最大程度，因此选择15 min作为反应时间。实验考察了1．0×1007mol/L尿酸在pH 5．8～8．0范围内的电化学发光现象。结果表明，随着pH值增大，抑制效果先增大后减小，当pH=7．4时，抑制效果最大。因此选择pH 7．4的缓冲溶液进行后续实验。

3．5干扰实验

在最佳实验条件下，当尿酸浓度为1．0×1007mol/L，相对误差不超过±5%时，1000倍的K+，Na+，Fe2+，Zn2+，Ca2+，Mg2+，Cl0;500倍的葡萄糖、尿素、蔗糖;100倍的L-谷氨酸、L-赖氨酸、羟脯氨酸、抗坏血酸不干扰测定;50倍的草酸干扰测定，实验采取加入Ca2+消除干扰。

3．6传感器对尿酸的电化学发光响应

在优化实验条件下，按实验方法测定不同浓度尿酸电化学发光强度并绘制工作曲线(图7)。电化学发光强度和尿酸浓度(1．0×10010～1．0×1005mol/L)的负对数呈良好的线性关系，线性方程为: IECL=0709．52－202．74lg C，相关系数R=0．9936，检出限(S/N=3)为6．0×10012mol/L。

图6　1．0×1007mol/L尿酸电化学发光强度与反应时间的响应曲线Fig．6　ECL intensity-time curves of 0．1 mol/L PBS(pH 7．4)containing 1．0×1007mol/L uric acid

图7　不同浓度尿酸电化学发光响应曲线Fig．7　ECL intensity-potential curves with different concentrations of uric acid．(a)blank，(b)1．0×10010mol/L，(c)　1．0　×　1009mol/L，(d)　1．0　×　1008mol/L，(e)1．0×1007mol/L，(f)1．0×1006mol/L，(g)1．0× 1005mol/L．Inset:calibration curve for uric acid

3．7传感器的重现性和稳定性分析

用同一支传感器对1．0×10-8mol/L尿酸连续测定11次，电化学发光强度相对偏差为2．9%，用同一批次的5支传感器对1．0×10-8mol/L尿酸进行测定，电化学发光强度相对偏差为3．1%，说明此传感器有较好的重现性。为考察传感器的稳定性，使传感器吸附1．0×10-8mol/L尿酸溶液后，置于4℃下保存，定期测定电化学发光信号值。14天内，电化学发光强度几乎不变，说明传感器的稳定性较好。

3．8样品测定

取3份新鲜尿液0．5mL于50mL容量瓶中，加入1．00mL 0．01mol/LCaCl2以除去用高纯水定容，再将该溶液稀释1000倍，以此为分析样品，按照实验方法进行测定，同时，进行加标回收实验，测定结果见表1。加标回收率为98．5%～103．5%，RSD为2．3%～3．1%，表明本方法可用于实际样品的测定。

表1　尿液样品分析及回收率实验Table 1　Determination result of uric acid in urine(n=11)

4　结论

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Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(No．30970696)．

2015年度《分析化学》最佳审稿专家

本刊2015年度收到论文千余篇，在广大分析化学专家的热情支持下，顺利完成全年的编辑出版工作，并荣获““中国百种杰出学术期刊(2014年度)”称号和“中国知网”评选的“2015中国最具国际影响力学术期刊”称号。衷心感谢广大分析化学工作者对本刊的支持与厚爱。为表彰在提高《分析化学》期刊学术质量工作中做出了突出贡献的审稿专家，编辑部举办了首届"最佳审稿专家"评选活动。此次评选主要依据审稿专家的审稿质量、审稿数量、审稿周期等评价指标，经综合评议，评选出了12名最佳审稿专家。名单公布如下:

Determination of Uric Acid Based on Chitosan/Ru(bpy)/SilicaNanoparticles Electrochem ilum inescence Sensor

FAN Xue-Mei1，WANG Shu-Min1，LIZhe-Jian1，ZHENG Xing-Wang2
1(College of Chemical Engineering and Modern Materials，Shangluo University，Shangluo 726000，China)2(School of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China)

Chitosan-Rucomposite nanoparticles(CRuS NPs)were prepared by reverse microemulsion method，and based on the Nafion/MCNT composite membrane technology，CRuS NPs were effectively andsteadilyimmobilizeonthesurfaceof aglassycarbonelectrodetopreparethe electrochemiluminescence sensor for uric acid determination．In 0．1 mol/L PBS(pH 7．4)buffer solution，whentheactuationdurationbetweenuricacidandthemodifiedelectrodewas15min，the electrochemiluminescence showed a good linear relationship to the negative logarithm of uric acid concentration in the range of 1．0×10-10－1．0×10-5mol/L，the linear equation was IECL=-709．52－202．74lg C and the correlation coefficient was 0．9936 with a detection limit of 6．0×10-12mol/L．The ECL sensor exhibited excellent repeatability and stability，and the RSD for 11 times determination of1．0×10-8mol/L uric acid was 2．9%．The recovery was 98．5%－103．5%in the determination of real Uric acid sample．

Electrogenerated chemiluminescence;Chitosan-Ru(bpy)nanoparticles;Uric acid

6 September 2015;accepted 29 December 2015)

姓名　单位　审稿论文(篇)邵学广　南开大学化学系　9郭伟强　浙江大学化学系　7尹学博　南开大学化学系　7胡斌　武汉大学化学系　7屠一峰　苏州大学化学系　6赵先恩　曲阜师范大学化学化工学院　6刘文涵　浙江工业大学化学工程与材料学院　6李攻科　中山大学化学化工学院　6邢志　清华大学化学系　6干宁　宁波大学理学院化学系　5栾天罡　中山大学生命科学学院　5韩鹤友　华中农业大学理学院　5

10．11895/j．issn．0253-3820．150705

2015-09-06收稿;2015-12-29接受

本文系国家自然科学基金(No．30970696);陕西省科技统筹创新工程计划项目(2012KTDZ02-02);商洛市科技局计划项目(SK-2014-4)及陕西省尾矿资源综合利用重点实验室项目(14SKY-FWK06)资助。

*E-mail:fanxuemei527@163．com