无静脉转流大动物劈离式原位肝移植模型的建立

付建峰，高伟，刘蕾，陈静，沈中阳（.天津医科大学一中心临床学院，天津3009；.天津市第一中心医院器官移植中心，天津 3009）

器官移植已经成为21世纪医学发展的主要方向之一，是根治终末期器官功能衰竭唯一有效的手段[1]。但目前供体严重短缺是制约器官移植发展的重要因素，为此，劈离式肝移植逐步发展起来。建立稳定的劈离式肝移植模型，对最大限度地利用供肝、增加供肝数量及儿童亲体肝移植具有重要意义。猪的肝脏解剖和生理特征与人类相近，是肝移植首选的模型动物。现将天津市第一中心医院器官移植中心2014年10月至2015年8月无静脉转流条件下猪劈离式原位肝移植模型建立的经验总结如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物：随机选取40只健康巴马小型猪，雌雄不限，10～12月龄，体重为30～35 kg。将实验动物随机分为供体组和受体组，每组20只，共实施20例劈离式原位肝移植术。

1.2 实验方法

1.2.1 术前准备与麻醉：术前禁食24小时，禁水12小时。经供体臀大肌肌注戊30 mg/kg巴比妥钠、0.1 mg/kg咪达唑仑和0.03 mg/kg阿托品行麻醉诱导，麻醉后称重。将供体仰卧位固定于恒温动物手术台，胸前连接5导联心电监护，猪尾连接血氧饱和度探头用以检测脉搏和血氧饱和度。耳背静脉建立外周静脉通路，给予1 mg/kg氯化琥珀胆碱使其肌肉松弛后行气管插管，连接呼吸机行间歇正压通气，潮气量为10～12 ml/kg，呼吸频率为18～20次/分，I/E吸呼比为1：2。七氟烷吸入维持麻醉，间断静脉注射维库溴铵维持肌肉松弛。行右侧颈部切口游离颈总动脉、颈内静脉，经颈总动脉置管监测术中平均动脉压及心率。经颈内静脉置三腔管监测中心静脉压并作为术中、术后补液及取血通路。

1.2.2 供肝获取及修整

1.2.2.1 供肝获取：取腹部长正中切口，公猪切口时应注意避开阴茎及尿道。以湿盐水纱布保护脾及肠管并将其推向左下腹，于肝十二指肠韧带下缘游离胆总管、肝动脉及门静脉。于十二指肠上方离断胆总管。肝动脉向下游离至胃十二指肠动脉下2 cm处，结扎切断胃十二指肠动脉及胃左动脉，保留足够长的残端以备受体移植物动脉吻合。游离门静脉主干约5 cm，结扎幽门静脉。游离肝下下腔静脉至右肾上腺水平，注意切断肝下下腔静脉时应避开肝尾状叶包绕的下腔静脉段，以防止肝移植术后血管吻合口渗血。最后游离肝周韧带。在整个游离过程中应注意避免反复翻动肝脏，造成肝组织损伤，局部微血栓形成，影响供肝灌注。游离完成后经颈静脉通路推注12 500单位肝素行全身肝素化，5分钟后将灌注管路分别置入肝动脉和门静脉，1 m高重力灌注4℃乳酸林格液3 000 ml，同时钳夹肝下下腔静脉，沿肝上下腔静脉剪开膈肌，于膈肌孔上方1 cm处离断肝上下腔静脉，以使灌注液顺利流出，同时轻柔按摩肝脏。乳酸林格液灌注完毕后，继续灌注4℃的器官保存液（UW液）1 000 ml。完全离断肝下下腔静脉，取出供肝，迅速置于器官保存液中。

1.2.2.2 供肝修整：灌注完毕后，于供体UW液冰水浴中修整供肝并劈离。沿肝中裂画一标记线（图1），锐性割开肝脏表面被膜，用精细的蚊式止血钳依次钳夹分离肝实质，用4-0丝线仔细结扎切断小动脉、小静脉及肝内胆管分支，至门静脉左干位置游离彻底后结扎切断，注意勿损伤门静脉壁。显露第二肝门的肝左静脉主干后，以无损伤血管钳夹离断肝左静脉后，用5-0 prolene缝合左侧肝左静脉，保留右半肝作为供肝植入受体猪。修整肝动脉、门静脉、肝上下腔静脉及肝下下腔静脉便于缝合。结扎胆囊管，剪开胆囊底部，抽净胆汁后以0号丝线结扎。最后用滴水双极电凝镊预处理肝脏断面，减少再灌注后肝断面出血及胆瘘的出现。

图1 劈离线示意图

1.2.3 受体手术：麻醉、气管插管、建立术中监测后开腹，受体猪手术切口位置选取同供体。依次游离肝胆总管、肝动脉、门静脉及肝上下腔静脉、肝下下腔静脉。无肝期前应充分补液，若无肝期血压控制不理想，应根据具体情况泵入多巴酚丁胺维持无肝期平均动脉压不低于50 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），如遇顽固性低血压可适当应用去甲肾上腺素。依次阻断肝动脉、门静脉及肝上下腔静脉、肝下下腔静脉，此时，无肝期正式开始。离断相应血管，切除受体肝脏，迅速将供肝原位置入腹腔，用5-0 prolene连续缝合肝上下腔静脉，同时用常温的乳酸林格液冲洗出供肝中残余的UW液和酸性代谢产物。用6-0 prolene连续缝合门静脉，打结时预留约1 cm“生长因子”，以防术后血管狭窄[2]。门静脉吻合完毕后开放门静脉，经供肝的肝下下腔静脉残端放出肝内残余气体后夹闭肝下下腔静脉，开放肝上下腔静脉，此时无肝期结束。同时静脉滴入10 mg/kg甲泼尼龙，5%碳酸氢钠200 ml。劈离断面应无明显大量出血，以纱布暂时压迫。用5-0 prolene连续缝合肝下下腔静脉。此时应确切止血，包括检查各吻合口有无明显出血，处理肝脏劈离断面。采用滴水双极电凝镊和prolene缝扎结合的方法确切止血，直至无肉眼可见出血。以8-0 prolene吻合肝动脉。最后吻合胆总管，采用潘明新等[3]研究中的套管法吻合，用0号慕丝线固定。复温水冲洗腹腔，将供肝结扎后的胆囊与腹膜牵拉固定，以摆正肝脏位置，防止吻合血管扭转及狭窄。放置腹腔引流管，拔除颈内动脉插管并结扎颈内动脉，保留并固定颈内静脉插管用于术后给药、补液和取血。

1.2.4 术后管理：动物饲养室的温度应保持在26～28℃左右，术后猪可自行排尿，第2天自由进食进水。术后每日两次给予头孢呋辛钠0.75 g，连用3天抗感染，抗排斥治疗参考经典原位肝移植术后的方案[4]，以他克莫司（0.04 mg/kg，每日1次×4天）联合甲泼尼龙（剂量每日递减，每日1次×4天，每日剂量分别为5、4、3、2 mg/kg）抗排斥，根据每天失血量、血糖水平、血气分析等结果调整酸碱平衡及补液量。

1.3 术中监测：术中持续监测受体的平均动脉压、中心静脉压和心率，分别于无肝期前、无肝期、新肝期10分钟及关腹前取血，监测其血气分析情况。

1.4 统计：实验数据采用SPSS 19.0统计软件包处理，计量资料均采用均数±标准差（±s）表示，不同时间点间差异采用重复测量数据的方差分析，两组之间比较采用最少显著性差异法，P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 手术基本情况：供肝冷缺血时间为（246.30±34.58）分钟，修肝及劈离时间为（32.25±3.41）分钟，无肝期时间为（19.35±4.09）分钟，受体手术时间为（282.75±31.14）分钟。劈离后用于移植的右半肝体积占完整供肝体积的（53.20±5.48）%。无肝期结束后数分钟内可见金黄色胆汁引出。20只猪劈离式原位肝移植模型受体中，术后2只由于肝劈离面出血过多导致麻醉复苏失败，其余18只复苏成功并拔管，术后第2天受体可正常进食水，术后第3天有3只受体猪因腹腔感染死亡，术后5天存活率为65%。

2.2 术中血流动力学参数变化（表1）：与无肝期前相比，无肝期受体猪的平均动脉压、中心静脉压明显降低，心率明显增快 （均P＜0.05）。新肝期后，平均动脉压、中心静脉压逐渐上升，心率逐渐下降，通过快速输注胶体液（羟乙基淀粉），关腹前恢复至无肝期前水平。

表1 20只受体猪术血流动力学变化（±s）

表1 20只受体猪术血流动力学变化（±s）

注：与无肝期前比较，aP＜0.05

检测时间 平均动脉压（mmHg）中心静脉压（cmH2O）心率（次/分）无肝期前 105.3±10.0 5.51±4.06 121.9±8.8无肝期 58.5±8.2a 2.17±2.11a 151.3±16.0a新肝期 85.1±14.8a 4.62±3.20 136.0±10.1a关腹前 97.9±12.9 5.67±3.17 121.3±11.7

2.3 术中血气分析指标变化（表2）：与无肝期前相比，术中无肝期各项指标无明显变化；与无肝期相比，新肝期时，pH值显著下降，K+浓度、乳酸浓度显著升高（均P＜0.05）；随着补液调整，至手术结束时pH值、K+浓度恢复正常，乳酸维持在较高水平。

表2 20只受体猪术中血气分析变化（±s）

表2 20只受体猪术中血气分析变化（±s）

注：与无肝期比较，aP＜0.05

检测时间 pH值 K+（mmol/L）乳酸（mmol/L）无肝期前 7.534±0.078 3.52±0.31 3.51±1.54无肝期 7.514±0.071 3.36±0.28 3.39±1.03新肝期 7.307±0.083a 5.86±0.71a 6.53±1.54a关腹前 7.438±0.076 3.64±0.36 6.38±1.55a

3 讨 论

肝移植是目前治疗终末期肝病唯一有效的手段，随着这项技术的成熟，等待移植的患者数量迅速增加，越来越多的患者在等待移植过程中死亡。为此劈离式肝移植应运而生，此术式是基于肝脏为功能性分段器官的理论，将一个完整的尸体供肝分割成2个或2个以上的解剖功能单位，分别移植给不同受者，以达到“一肝两受”或“一肝多受”的目的。该术式的出现有效地增加了儿童患者的供肝来源，同时又不减少成人供肝的数量。随着劈离式肝移植技术的发展，相关的实验研究也逐步发展起来。

猪的肝脏解剖与人相近，病理生理特点也与人相似，所以常用猪作为大动物肝移植模型，而小型巴马猪是理想的实验动物[5]。小型巴马猪的肝分为右外侧叶、中叶、左外侧叶和尾状叶。其中，中叶有肝中裂，把中肝又分为左中叶和右中叶，尾状叶很小并与右外侧叶相连。胆囊位于右中叶。门静脉由脾静脉和肠系膜上静脉汇合而成，门静脉在接近肝实质处分出左右两个主要分支，在左右肝叶间门静脉几乎没有交通支[6]，这一结构有利于自肝中裂将猪肝分离为左右两半肝。由于我们只做右半肝移植，所以不必将劈离线选为Taira线[7]，而是参照Kelly等[8]将劈离线选在肝中裂（图1）的位置，发现经该位置劈离肝实质内血管胆管交通支较少，可较彻底地对其进行结扎切断，降低出血及胆瘘的可能。劈离至门静脉向左的分支处，此处门静脉无其他侧支，游离彻底后以丝线结扎切断即可。向上劈离至第二肝门的肝左静脉主干，由于此静脉较宽扁，直径较大，以无损伤血管钳夹离断后需用5-0 prolene缝合，止血较为确切。劈离式肝移植的目的是“一肝两受”或“一肝多受”，右半肝行原位肝移植，左半肝的移植行背驼式肝移植。但是由于猪的肝脏并不像人，能完全劈离成两个可用的肝脏，如将左半肝行背驼式肝移植，需保留完整的下腔静脉，而肝脏与下腔静脉交通支极多，处理后难以完全止血；或者重建下腔静脉，则增加手术难度和时间，致使无肝期时间过长。我们的研究目的主要是探究肝脏劈离的过程，只需对比同侧肝脏移植后的效果，因此，本研究仅行右半肝移植手术，便于手术成功及进一步研究的顺利进行。

猪肝动脉与人的解剖有差异，其较早发出数个分支，故全肝移植时多从腹腔动脉起始处开始游离，结扎胃十二指肠动脉及胃左动脉，并保留胃左动脉发出的至左肝的分支。但由于本研究中劈离式肝移植只需要右半肝，故可只在肝十二指肠韧带处游离肝动脉，胃左动脉发出至左肝的分支亦可结扎切断。

无肝期开始后，由于下腔静脉阻断，血液回心受阻，导致平均动脉压和中心静脉压迅速下降，此时血压下降并非血容量不足造成的，故应尽量减少补液，适当应用血管活性药物可保持血流动力学相对稳定。门静脉开放后，血液回心增多，平均动脉压和中心静脉压迅速回升。此时应减慢补液速度，并逐步减少血管活性药物的使用。劈离后的肝脏体积小，术野好，故应尽量减少无肝期时间以降低对机体的打击，一般将无肝期控制在30分钟之内[9-10]。本研究将无肝期时间控制在（19.35±4.09）分钟，能够较好地保证手术的成功率。无肝期结束后，应确切止血。除了对各个血管吻合口确切止血，劈离式原位肝移植还需要对劈离面进行确切止血，有时劈离面出血较严重，可对猪行额外补液或输血，然而由于门静脉的高灌注，补液过多会导致微血管压力增高，止血难度增加，所以应严格控制补液量及补液速度，整个受体手术过程中总补液量约为5 000 ml。

由于劈离后肝脏体积减小约1/2，移植后肝脏所占空间变小，肝脏容易移位导致吻合血管狭窄及血栓的形成，经验表明，将结扎后的胆囊壁与左侧腹膜固定，可以使肝脏处于一个相对固定的状态，从而防止此类术后并发症的发生。

目前，国内外关于猪劈离式肝移植的研究很少，小动物难以完成劈离式肝移植，所以研究劈离式肝移植的相关内容必须使用大动物模型。而大动物减体积肝移植的存活率不高[8，11]，我们建立了无静脉转流猪劈离式原位肝移植模型，实验初期由于对劈离面的处理经验不足，导致术中止血难度增加从而对肝功能产生较大的影响。此外，术中尤其是无肝期前后血流动力学和血气分析结果波动大，应通过无肝期快速补液、适量给予血管活性药物以维持血流动力学稳定，并尽量缩短无肝期时间，这样建立的模型术后存活率较高。