小苍兰花瓣主要花色苷组分研究

徐怡倩 袁 媛 陶秀花 杨 娟 史益敏 唐东芹*

(1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240； 2.江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，南昌 330200； 3.上海市花卉良种试验场，上海 201615)

* 通信作者：E-mail:dqtang@sjtu.edu.cn

小苍兰花瓣主要花色苷组分研究

徐怡倩1袁 媛1陶秀花2杨 娟3史益敏1唐东芹1*

(1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，南昌 330200；3.上海市花卉良种试验场，上海 201615)

以6个小苍兰(Freesiahybrida)园艺品种为研究材料，采用英国皇家园艺学会比色卡进行花色描述，利用特征颜色反应确定其色素类型，进而通过UPLC-PAD结合UPLC-Q-TOF-MS技术分析各品种中的花色苷种类及含量。结果表明，6个小苍兰品种可分为白色系、橙—黄色系以及紫—紫红—蓝紫系三大色系。小苍兰6个品种花瓣中均含有黄酮类色素，不含或含极低量类胡萝卜素，除‘上农乳香’以外，其余品种花瓣中均含有花色苷。花瓣中花色苷含量依小苍兰品种不同而各异，5个含花色苷的品种中，‘上农紫玫瑰’花瓣中花色苷含量最高，‘上农橙红’次之。在小苍兰花瓣中，共检测到6种花色苷物质，通过与已有文献比对分析，推定其成分为：飞燕草3,5-二葡萄糖苷、矮牵牛素3,5-二葡萄糖苷、飞燕草3-葡萄糖苷、锦葵素3,5-二葡萄糖苷、牵牛花素3-葡萄糖苷和锦葵素3-葡萄糖苷。‘上农紫雪青’和‘上农宫粉’花瓣中含有3种花色苷，且均含锦葵素类和矮牵牛素类，其中‘上农紫雪青’花瓣中主要成分是锦葵素单糖苷和双糖苷；而‘上农宫粉’花瓣中则均为双糖花色苷，主要成分是矮牵牛素3,5-二葡萄糖苷、锦葵素3,5-二葡萄糖苷和飞燕草3,5-二葡萄糖苷；‘上农紫玫瑰’花瓣中含矮牵牛素3-葡萄糖苷和飞燕草3-葡萄糖苷；而‘上农金皇后’和‘上农橙红’花瓣中仅含一种组分，分别为飞燕草3,5-二葡萄糖苷和锦葵素3,5-二葡萄糖苷。

香雪兰；花色；花色苷；液质联用

花色是决定很多园林植物观赏性的重要因素，绝大多数植物累积特定的花色素种类，从而呈现出一定的花色表型[1～2]。花色变化受多种因素影响，其中色素种类及含量的时空组合对植物花色起决定性作用。影响花色的色素类物质大致可以分为类黄酮、类胡萝卜素和生物碱等，但是，花瓣所含色素的颜色与花色表现并不完全一致，因此针对花瓣中色素组分进行相应的定性和定量分析，有助于揭示花色表现的化学基础，阐明花色素存在的生理功能。通过化学分析手段，已明确花色苷类物质是大多数花色形成的关键色素，开展花色苷相关研究有积极意义。

小苍兰(Freesiahybrida)又名香雪兰，是鸢尾科(Iridaceae)香雪兰属(Freesia)多年生球茎植物，目前广泛栽植的是园艺杂交品种，花色非常丰富[3]。花色是决定小苍兰的重要观赏指标之一，因此研究其花瓣花色素组成有重要意义。迄今为止，国内外对小苍兰的研究多数集中在繁殖育种与栽培技术、花芽分化与花期调控、种球休眠生理、组织培养、切花保鲜等方面[4～7]，关于小苍兰花瓣花色素的研究资料甚少，国内仅见有关部分品种的花色素成分与稳定性初步分析[8]，以及测定其挥发性成分的报道[9]。本课题组持续30多年对小苍兰进行研究与实践，目前已培育新品种10多个，并开展了较为系统的科学研究。本文拟通过花色描述、特征颜色反应及UPLC-Q-TOF-MS技术对小苍兰6个自有品种的花色、花色素类型及其花瓣中的花色苷含量、花色苷组分进行定性和定量分析，旨在为新品种推广以及后续开展小苍兰花色素的纯化、分离、鉴定等工作奠定基础，并为深入开展关于小苍兰花色形成的生化途径、生理机制、花色的改良育种等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料及采集方法

本研究选择了小苍兰(Freesiahybrida)6个自育品种为研究材料，分别是‘上农紫雪青’、‘上农紫玫瑰’、‘上农宫粉’、‘上农橙红’、‘上农金皇后’以及‘上农乳香’，其花瓣颜色分别为紫、紫红、粉红、黄、橙红、白(图1)。

图1 小苍兰6个品种的花色表型a.‘上农紫雪青’；B.‘上农紫玫瑰’；C.‘上农宫粉’；D.‘上农橙红’；E.‘上农金皇后’；F.‘上农乳香’Fig.1 Flower color phenotype of six F.hybrida cultivarsa.‘Shangnong Zixueqing’; B.‘Shangnong Purple Rose’; C.‘Shangnong Gongfen’; D.‘Shangnong Chenghong’; E.‘Shangnong Golden Queen’; F.‘Shangnong Ruxiang’

2014年3月中下旬，于小苍兰盛花期，在上午9～10时，分别从不同单株(>3株)上剪取花朵完全开放的整支花序，装入塑料自封袋内。各品种分别留取15～20朵小花进行花色描述及色素定性，将剩余小花分为3份，每份鲜样1.0 g，用铝箔纸包好，液氮速冻，-80℃冰箱储存备用。

1.2 花色描述

分别取6个品种的新鲜花瓣，放置于光线良好的室内，避免日光直射，将花瓣中上部分与英国皇家园艺学会比色卡(Royal Horticultural Society Color Chart，RHSCC)进行对比，描述花色[10]。重复10次，取出现频率最高的结果。

1.3 花色素定性分析

取小苍兰各品种的新鲜花瓣各0.1 g，分别加入5 mL石油醚、5 mL 10%盐酸以及5 mL 30%氨水，记录提取液颜色的变化情况[11]。

1.4 总花色苷含量测定

花瓣中花色苷的提取参考孙卫等的方法[12]。

色谱柱：Waters ACQUITY UPLCBEHC18反相硅胶柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。UPLC分析条件：柱温45℃，流速0.4 mL·min-1，进样体积3 μL；流动相：A液：0.1%的甲酸溶液(V甲酸∶V水=0.1∶99.9)；B液：含0.1%甲酸的乙腈(V甲酸∶V乙腈=0.1∶99.9)。梯度洗脱程序：0 min，95% A，5% B；0.5 min，95% A，5% B；2.5 min，82% A，18% B；7.5 min，65% A，35% B；11 min，35% A，65% B；12 min，0% A，100% B；13 min，0% A，100% B；13.5 min，95% A，5% B；15 min，95% A，5% B。

在特征吸收波长520 nm检测总花色苷(total anthocyanins，TA)含量。以标准品氯化矢车菊(cyanidin chloride)作为外标，通过标准曲线法对对花瓣TA进行定量。TA为每克新鲜花瓣中含有的相对于cyanidin的含量[13]。

1.5 花色苷组分分析

采用超高效液相色谱—四极杆飞行时间质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS)对花瓣中花色苷结构进行分析。UPLC配备同上，四级杆飞行时间质谱仪为Bruker公司生产，采用Hystar工作站。花色苷色谱分析条件同上，质谱分析条件：电喷雾电离，正离子检测模式，扫描范围为100～1500 m·z-1；毛细管电压3 000 V，锥孔电压30 V，提取锥电压4 V；锥孔气流量60 L·h-1，脱溶剂气流量600 L·h-1，干燥气(N2)流速0.3 mL·min-1；离子源温度110℃，干燥温度350℃。

1.6 数据分析

数据整理、分析及作图使用软件Microsoft Office Excel 2003，花色苷含量用平均值进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 小苍兰花色描述

根据皇家园艺比色卡(RHSCC)对花色的描述，6个小苍兰品种可分为三大色系(表1)：(1)紫、紫红、蓝紫系：‘上农紫雪青’、‘上农紫玫瑰’和‘上农宫粉’；(2)橙、黄色系：‘上农橙红’和‘上农金皇后’；(3)白色系：‘上农乳香’。

表1 小苍兰花色描述

2.2 小苍兰花色素类型的定性分析

定性试验中，小苍兰品种的花瓣色素提取液发生不同的特征颜色变化(表2)。石油醚测试中，提取液均为无色，说明所有品种花瓣均不含或含极低量类胡萝卜素。盐酸反应中，‘上农紫雪青’、‘上农紫玫瑰’、‘上农宫粉’、‘上农橙红’、‘上农金皇后’等5个品种分别显示不同程度的黄色、橙红色、紫红色、橙黄色等，说明这些品种的花瓣含有花色苷，而‘上农乳香’花瓣在盐酸的作用下呈现淡黄色，表明这个品种花瓣中不含或含极低量花色苷；氨水测试中，所有小苍兰品种的花瓣色素提取液均呈现黄色、橙黄色或黄绿色，说明所有品种的花瓣中含黄酮类化合物，但不同品种之间含量存在一定差异。

表2 小苍兰花色素类型测试颜色反应

因此，根据颜色反应结果可以发现，6个小苍兰品种花瓣中均含有黄酮类色素，不含或含极低量类胡萝卜素，同时，除‘上农乳香’以外，其它5个小苍兰品种花瓣中均含花色苷。

2.3 小苍兰花色苷成分分析

将经颜色反应证实含有花色苷的5个小苍兰品种的花瓣色素提取液通过滤膜过滤后上样，经UPLC-PDA进行分离后检测样品中花色苷的分离情况。结果表明，5个含花色苷的小苍兰品种花瓣提取液经C18柱分离，在520 nm波长下共检测到6种花色苷物质(表3)。各花色苷物质的结构由UPLC-Q-TOF-MS分析进一步确定。

花色苷组分1由图2的质谱图分析得到分子离子m/z627[M]，碎片离子m/z465[M-162(glucose)]+、303[Y0]+。m/z303为飞燕草苷元(Delphinidin)的特征质荷比，两个糖苷多结合在花色苷元的3位和5位，通过与相关文献中花色苷质谱特征的比对，组分1推定为飞燕草3,5-二葡萄糖苷(Delphinidin3,5-di-O-glucoside)。花色苷组分2质谱分析得到分子离子m/z 641[M]，碎片离子m/z479[M-162(glucose)]+、317[Y0]+，m/z317为矮牵牛素苷元(Petunidin)的特征质荷比，质谱特征与矮牵牛素3,5-二葡萄糖苷(Petunidin3,5-O-glucoside)相对应，因此推定组分2为矮牵牛素3,5-二葡萄糖苷。组分3质谱分析得到分子离子m/z465，碎片离子303[Y0]+，对应飞燕草3-葡萄糖苷(Delphinidin3-O-glucoside)的质谱特征；同理，根据质谱特征，组分4～6依次被推定为锦葵素3,5-二葡萄糖苷(Malvidin3,5-O-glucoside)、牵牛花素3-葡萄糖苷(Petunidin3-O-glucoside)以及锦葵素3-葡萄糖苷(Malvidin3-O-glucoside)。

表3小苍兰品种花瓣中花色苷的光谱及质谱特征

Table3SpectrumandUPLC-MSprofilesofanthocyaninsinpetalsofF.hybrida

色谱峰Peak保留时间tRMaintenancetime(min)分子及碎片离Molecular&Fragmentions(m/z)推定结果Tentativeidentification11.63627,465,303飞燕草3,5-二葡萄糖苷Delphinidin3,5-O-glucoside22.12641,479,317矮牵牛素3,5-二葡萄糖苷Petunidin3,5-O-glucoside32.17465,303飞燕草3-葡萄糖苷Delphinidin3-O-glucoside42.56655,493,331锦葵素3,5-二葡萄糖苷Malvidin3,5-O-glucoside52.63479,317矮牵牛素3-葡萄糖苷Petunidin3-O-glucoside63.05493,331锦葵素3-葡萄糖苷Malvidin3-O-glucoside

图2 小苍兰花色苷的MS图谱Fig.2 MS chromatograms of the anthocyanins in flowers of F.hybrida

综上，5个含花色苷的小苍兰品种中一共检测到6种花色苷物质，它们分别为：飞燕草3,5-二葡萄糖苷、矮牵牛素3,5-二葡萄糖苷、飞燕草3-葡萄糖苷、锦葵素3,5-二葡萄糖苷、牵牛花素3-葡萄糖苷和锦葵素3-葡萄糖苷。

2.4 小苍兰花瓣花色苷含量

2.4.1 总花色苷含量

小苍兰品种花瓣中所含总花色苷含量如图3所示。由于‘上农乳香’花瓣中不含或含极低量花色苷，因此这一品种花色苷总含量未在图中表示。测定结果表明，不同小苍兰品种花瓣中的总花色苷含量存在较大差异，其中‘上农紫玫瑰’花瓣中花色苷总含量最高，高达1 637 μg·g-1，其余品种花瓣中总花色苷含量则均在400 μg·g-1以下。分别为‘上农橙红’335 μg·g-1、‘上农紫雪青’247 μg·g-1及‘上农宫粉’205 μg·g-1。‘上农金皇后’含量最低，仅196 μg·g-1，仅相当于‘上农紫玫瑰’的12%。

图3 5个小苍兰品种花瓣中总花色苷含量Fig.3 Total anthocyanins content in the petals of five cultivars of F.hybrida

2.4.2 花色苷组成

小苍兰花瓣花色苷的组成及百分含量如表4所示。不同品种花瓣中分别含1～3种花色苷，没有一个品种同时含6种花色苷。紫、紫红、蓝紫系品种中‘上农紫雪青’和‘上农宫粉’花瓣中含有3种花色苷，且均含锦葵素类和矮牵牛素类。但‘上农紫雪青’花瓣中主要成分是锦葵素单糖苷和双糖苷，占花色苷总含量的75%以上，而‘上农宫粉’花瓣中则均为双糖花色苷，主要成分是矮牵牛素3,5-二葡萄糖苷，占花色苷总含量的44.1%，其后依次是锦葵素3,5-二葡萄糖苷、飞燕草3,5-二葡萄糖苷，占花色苷总含量的32.6%和23.3%。同一色系另一品种‘上农紫玫瑰’的花瓣中花色苷以矮牵牛素3-葡萄糖苷为主，含量占花色苷总含量的60%以上，其余为飞燕草3-葡萄糖苷。橙、黄色系品种‘上农金皇后’和‘上农橙红’的花瓣中有且仅有一种主要的花色苷组分，分别为飞燕草3,5-二葡萄糖苷和锦葵素3,5-二葡萄糖苷。

表45个小苍兰品种中各花色苷所占比例

Table4DistributionofanthocyanincomponentsinpetalsoffivecultivarsofF.hybrida

品种Cultivar各花色苷占花色苷总量的比例Distributionofeachcomponent(%)123456上农金皇后‘ShangnongGoldenQueen’100上农紫玫瑰‘ShangnongPurpleRose’38.9161.09上农宫粉‘ShangnongGongfen’23.3444.1032.56上农乳香‘ShangnongRuxiang’上农紫雪青‘ShangnongZixueqing’24.7638.1037.14上农橙红‘ShangnongChenghong’100

注：表中1～6表示2.3节中推定的6种花色苷组分。

Note:The numbers 1-6 in this table represent the nine anthocyanins in section 2.3.

3 讨论

花色苷是花朵呈现红色、橙色、粉色、紫色的主要色素来源，类胡萝卜素则主要使花朵呈现黄色或红色[1,14]。钟淮钦等的研究结果表明，小苍兰花瓣中主要是以类黄酮为母核的一类物质，即类黄酮决定小苍兰的花色[8]。我们的试验研究发现，6个小苍兰品种花瓣中均含类黄酮花色素，但不含或含极低量胡萝卜素，与上述研究结果是一致的。花色苷是类黄酮类化合物中的一大类，在植物花色素中占重要地位，但目前尚未见关于小苍兰花色苷组分的定性研究。定性分析试验发现，所试小苍兰品种中有5个品种的花瓣中含花色苷，因此，我们进一步通过液质联用技术，通过与已有文献的光谱、质谱特征进行比较，首次对小苍兰的花色苷组分进行了定量分析，成功分离并推测确定了6种花色苷组分结构，为今后深入开展其花色苷研究及花色育种提供了良好基础。

花朵的颜色被不少研究证实与花色苷种类及花色苷含量密切相关[10～12,15]。在本研究中，‘上农紫玫瑰’花瓣中花色苷总含量最高，相应地，其花色也较深，其它品种花瓣中总花色苷含量则相对较低，花色则相应较浅。不仅含量不同，同一色系不同品种花色苷组分也存在差异，如紫、紫红、蓝紫系3个品种中‘上农紫雪青’与‘上农宫粉’含3个组分，‘上农紫玫瑰’则2个，且组分种类和相对含量均存在差异。同样，橙、黄色系中‘上农橙红’花色苷总含量高于‘上农金皇后’，其花瓣颜色也深；虽然均只含一种花色苷组分，但种类却不同，从而产生花色的差异。锦葵素和矮牵牛素呈现紫红色或蓝紫色，飞燕草素呈现蓝色至蓝紫色[1]，这是‘上农紫玫瑰’和‘上农紫雪青’两个品种呈现紫色基调色的生化基础，与前人的研究结果是一致的[2,8]。而橙、黄色系‘上农橙红’和‘上农金皇后’中虽然也含有锦葵素或飞燕草素，但其花朵颜色却是橙红色和黄色，原因可能是因为这两个品种的花瓣中含有更大量的其它类黄酮类色素，从而影响了花色苷对花瓣着色的表型影响，同时，也可能是受花瓣细胞形状、液泡内酸碱度、细胞内金属离子种类和浓度、甚至是外部环境因子等因素的影响所致[14,16]。因此，后续将进一步围绕花色苷稳定性分析以及黄酮类色素组分的分离展开研究，为将来全面阐述小苍兰成色机理提供更为详实的证据。

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MainAnthocyaninProfilesinPetalsofFreesiahybrida

XU Yi-Qian1YUAN Yuan1TAO Xiu-Hua2YANG Juan3SHI Yi-Min1TANG Dong-Qin1*

(1.School of Agriculture & Biology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240；2.Vegetable and Flower Institute,Jiangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanchang 330200；3.Shanghai Floriculture Experimental Farm,Shanghai 201625)

We analyzed the anthocyanin profiles in 6 cultivars of freesia(Freesiahybrida). The petal color was observed according to the Royal Horticultural Society Color Card(RHSCC). Petal pigment type was identified by characteristic color reaction. UPLC-PAD and UPLC-Q-TOF-MS were used for qualitative and quantitative analysis of anthocyanins. The flavonoids in petals of all cultivars were detected, while carotenoids were not detected; meanwhile, every cultivar, except for ‘Shangnong Ruxiang’, contained anthocyanins in petals. Among five anthocyanin-contained cultivars, the highest anthocyanin content was observed in ‘Shangnong Purple Rose’, followed by ‘Shangnong Chenghong’. Totally 6 anthocyanin components were detected in petals of these cultivars, including Delphinidin 3,5-O-glucoside, Petunidin 3,5-O-glucoside, Delphinidin 3-O-glucoside, Malvidin 3,5-O-glucoside, Petunidin 3-O-glucoside and Malvidin 3-O-glucoside. Three anthocyanin components were detected in petals of ‘Shangnong Zixueqing’ and ‘Shangnong Gongfen’, of which were majorly malvidin and petunidin derivated anthocyanins. Malvidin-anthocyaninswith single or double glucosides was present in petals of ‘Shangnong Zixueqing’, while all anthocyanins in petals of ‘Shangnong Gongfen’ bonded with double glucosides, such as Delphinidin 3,5-O-glucoside, Petunidin 3,5-O-glucoside and Malvidin 3,5-O-glucoside, major Petunidin 3-O-glucoside and minor Delphinidin 3-O-glucoside in petals of ‘Shangnong Purple Rose’. While only one anthocyanin component was detected in petals of ‘Shangnong Golden Queen’ and ‘Shangnong Chenghong’, which was Delphinidin 3,5-O-glucoside and Malvidin 3,5-O-glucoside, respectively.

freesia;flower color;anthocyanin;UPLC-MS

上海市农委科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2014)第1-2号]

徐怡倩(1993—)，女，本科，主要从事观赏园艺研究。

2015-09-29

Q949.71+8.28

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.005